本发明专利技术涉及利用蛋白质反式剪接技术将化学基团定点修饰到蛋白质C-端的技术。具体地，本发明专利技术提供了利用蛋白质反式剪接技术将聚乙二醇(PEG)修饰到粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人类生长激素(hGH)、人类干扰素α 2b(IFN α 2b)、白细胞介素-15(ILK-15)和尿酸氧化酶(UOX)C端的技术，以及提供了制备上述定点C-端修饰的药物的方法。同时，还提供了用于定点修饰蛋白质多肽药物的蛋白质内含子序列。
Protein with chemical modification group and preparation method thereof
The invention relates to a method for fixing a chemical group to the C- end of the protein by using the protein trans splicing technology. Specifically, the invention provides the use of protein trans splicing technology of polyethylene glycol (PEG) modification to granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and human growth hormone (hGH), human interferon alpha (IFN alpha 2b 2b) and interleukin -15 (ILK-15) and uric acid oxidase (UOX) C terminal technology, and provides a method for preparing the drug modified the end point C-. In addition, a sequence of protein introns for site directed modification of protein polypeptide drugs is also provided.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质药物修饰领域。本专利技术涉及利用蛋白质反式剪接技术将化学基团定点修饰到蛋白质C-端的技术。还提供了制备多种聚乙二醇化药物，以及制备方法。同时，还提供了用于定点修饰蛋白质多肽药物的蛋白质内含子序列。
技术介绍
聚乙二醇(PEG)化学修饰是延长蛋白多肽类药物在体内半衰期的一个有效途径。修饰了聚乙二醇的蛋白质的构象、静电吸附和亲疏水性等物理化学性质会发生变化。这些物理和化学的变化使聚乙二醇化的药物蛋白质明显优于普通的蛋白质多肽类药物。聚乙二醇化的蛋白质多肽类药物的优点主要体现在：增加了药物溶解性，提高了药物稳定性，降低了免疫原性，减少肾的过滤作用和有效的保护蛋白质多肽药物免遭蛋白水解酶将其分解。在聚乙二醇化的过程中，最大的技术挑战之一就是特异性。在很多情况下要求将聚乙二醇修饰到蛋白的特定位点，而且修饰后聚乙二醇分子和蛋白质的分子比例应该为1：1。然而，在蛋白质分子中通常会出现多个修饰位点(-SH,-NH2等)，由于是随机修饰，修饰的位点不均一，修饰聚乙二醇的数目也不均一，导致PEG修饰产物是混合物。而且，这些异构体的生物活性也不相同，导致规模化制备时难以实现批次间的稳定性，有时难以达到药物生产和新药申报的要求。为了解决这个问题，目前有些研究做了定点修饰方面的研究。例如，有些方法是蛋白质N-末端的聚乙二醇修饰(例如美国专利NO.6077939；美国专利NO.7090835；美国专利NO.5621039)。此外，还有一种方法是像蛋白质药物中引入游离的半胱氨酸，用来进行定点修饰(美国专利NO.7214779)。还有一种方法是向蛋白质中引入非天然氨基酸，作为定点修饰的位点(美国专利NO.7230068)。然而这些方法都有局限性，例如，这些方法的步骤复杂，费时费力。而且修饰效率很低，降低了药物蛋白的活性(蛋白没有正确折叠)。同时，这些方法还会产生副产物，这样会导致药物的活性受影响，去除这些副产物的工作也同样巨大。而且为了优化这些过程，可能要突变一些氨基酸作为多聚物的靶点。然而，突变的氨基酸可能会导致药物多肽丧失活性(例如，二级结构和蛋白构象的变化)。所以，需要一种新型的定点修饰方法用来克服上述困难。基于蛋白质反式剪接技术，本专利技术提供了一种定点修饰蛋白质C-末端的技术。蛋白质反式剪接(proteintrans-splicing)是由蛋白质内含子(intein)介导。蛋白质内含子是具有自我催化活性的蛋白质，翻译后，蛋白质内含子片段会从蛋白质前体中剪掉，并以肽键连接两侧蛋白质外显子(extein)，形成成熟蛋白质。断裂蛋白质内含子(splitintein)在蛋白质内含子中部区域特定位点发生断裂，形成N端片段(IN，Npartofintein)和C端片段(IC,Cpartofintein)，这种内含子可以结合重构形成有功能的蛋白质内含子，也可以催化蛋白分子间的反式剪接反应。此外，蛋白质反式剪接不但可以在生理条件下进行，而且可以在蛋白浓度相对较低的情况下进行。反式剪接为蛋白质特异位点修饰提供了一种新方法。
技术实现思路
为了解决蛋白质多肽药物修饰领域的非特异性修饰问题和弥补现有技术的不足，本专利技术提供了利用蛋白质反式剪接技术将化学基团定点修饰到蛋白质多C-端的技术。本专利技术首次利用蛋白质反式剪接技术将聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)修饰到蛋白多肽类药物的特定位点，得到了组分均一的长效重组蛋白药物。这些被修饰的药物包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人类生长激素(hGH)、人类干扰素α2b(IFNα2b)、白细胞介素-15(ILK-15)和尿酸氧化酶(UOX)。本专利技术还提供了制备上述定点C-端修饰的药物的方法。同时，还提供了用于定点修饰蛋白质多肽药物的蛋白质内含子序列。本申请的一方面，在于提供了一种仅含有一个化学修饰位点的化学修饰蛋白的方法，其可以提供均一的定点修饰的蛋白质。该方法使用断裂蛋白内含子定点修饰，具体方法包括：i.制备C-蛋白(包括断裂蛋白内含子的C-段序列与第一氨基酸序列)并对所述C-蛋白进行化学修饰；ii.制备N-蛋白(包括断裂蛋白内含子的N-段序列与第二氨基酸序列)；iii.通过反式剪切技术将所述C-蛋白与N-蛋白相连接，其中，所述第一、第二氨基酸序列通过肽键相连接，其特征在于，所述C-段序列如SEQIDNO:1所示，所述N-段序列如SEQIDNO:2所示。需要说明的是，本申请中的断裂蛋白内含子并不限于如上序列，其他可行的序列包括：a.一种SspDnaB人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；b.一种SceVMA人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；c.一种NpuDnaE断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；d.一种TerThyX人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；e.一种SspDnaX人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；f.一种TerDnaE-3人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；g.一种CnePRP8人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；h.一种RmaDnaB人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体其中，第一氨基酸序列的序列如SEQIDNO:3所示，且第四位点为唯一的化学修饰位点，第二氨基酸序列代表一种蛋白多肽类药物的氨基酸序列。这些蛋白类多肽类药物包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人类生长激素(hGH)、人类干扰素α2b(IFNα2b)、白细胞介素-15(ILK-15)和尿酸氧化酶(UOX)。然而，本领域技术人员可以理解的是，本申请旨在提供一种具有一个且仅有一个化学修改位点的方法及对应的序列(即第一氨基酸序列)，而通过断裂蛋白内含子以及反式剪切技术与该段第一氨基酸序列连接的蛋白，则并不限于这些蛋白多肽类药物。本领域技术人员根据常规技术手段，可自由设计其他蛋白类药物，并将这些多肽与第一氨基酸序列连接。这些多肽例如为纤维蛋白原、白蛋白、红血球生成素(EPO)、人凝血因子VIII。其中，C-蛋白还包括组氨酸标签以及选自硫氧还蛋白(T蛋白)，麦芽糖结合蛋白(MBP蛋白)，SUMO蛋白，以及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的标签蛋白。同时，如前所述，由于C蛋白上具有化学修饰位点，该修饰位点上可修饰有本领域常见的用于提高蛋白性能或稳定性的化学基团，包括但不限于：聚乙二醇或聚乙二醇衍生物、MMAE和DM1。从而C(前体)蛋白可被标示为H(组氨酸标签)S(标签蛋白)IC(SspGyrB断裂蛋白质C-段序列)-SAGC(第一氨基酸序列)-mPEG(修饰的化学基团)其中，N-蛋白还包括组氨酸标签，即N(前体)蛋白可被标示为G-CSF(蛋白多肽，第二氨基酸序列)-IN(SspGyrB断裂蛋白质N-段序列)-H(组氨酸标签)。本申请的第二方面，在于提供一种使用如上方法所制备得到的，具有非常优异的均一性的修饰有化学基团的蛋白。该蛋白质由第一氨基酸序列以及第二氨基酸序列组成，第一、第二氨基酸序列通过肽键相连接，第一氨基酸序列的序列如SEQIDNO:3所示，且所述第四位点为化学修饰位点(且唯一)，第二氨基酸序列代表一种蛋白多肽类药物的氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用断裂蛋白内含子定点修饰蛋白质的方法，包括：i.制备包括断裂蛋白内含子的C‑段序列与第一氨基酸序列的C‑蛋白并对所述C‑蛋白进行化学修饰；ii.制备包括断裂蛋白内含子的N‑段序列与第二氨基酸序列的N‑蛋白；iii.通过反式剪切技术将所述C‑蛋白与N‑蛋白相连接，其中，所述第一、第二氨基酸序列通过肽键相连接，其特征在于，所述C‑段序列如SEQ ID NO:1所示，所述N‑段序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种使用断裂蛋白内含子定点修饰蛋白质的方法，包括：i.制备包括断裂蛋白内含子的C-段序列与第一氨基酸序列的C-蛋白并对所述C-蛋白进行化学修饰；ii.制备包括断裂蛋白内含子的N-段序列与第二氨基酸序列的N-蛋白；iii.通过反式剪切技术将所述C-蛋白与N-蛋白相连接，其中，所述第一、第二氨基酸序列通过肽键相连接，其特征在于，所述C-段序列如SEQIDNO:1所示，所述N-段序列如SEQIDNO:2所示。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一氨基酸序列的序列如SEQIDNO:3所示，且所述第四位点为化学修饰位点，所述第二氨基酸序列代表一种蛋白多肽类药物的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述C-蛋白还包括组氨酸标签以及选自硫氧还蛋白(T蛋白)，麦芽糖结合蛋白(MBP蛋白)，SUMO蛋白(S蛋白)，以及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的标签蛋白。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述N-蛋白还包括组氨酸标签。5.一种具有化学修饰基团的蛋白质，所述蛋白质由第一氨基酸序列以及第二...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴旭东，刘相钦，
申请(专利权)人：戴旭东，刘相钦，
类型：发明
国别省市：上海;31
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