一种琥珀酰‑β‑环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种琥珀酰‑β‑环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用。本发明专利技术的第一方面，提供了一种用于莱姆病检测的蛋白质芯片，包括固相载体和固定于所述固相载体上的捕获分子，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白（VlsE）。在检测时，每张芯片可同时检测多例血清样本，灵敏度、特异性均较高，减少组间检测假阳性和假阴性的发生几率。在与传统方法相比时，运用其对莱姆病高危地区的人群进行大规模筛查，可提供更为简便和可靠的检测方法，提高了筛查效率以及阳性检测率和准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种琥珀酰-β-环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用
本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种琥珀酰-β-环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用。
技术介绍
莱姆病(LymeDiseas，LD)是一种由蜱虫传播的旋体感染引起的累及皮肤、神经、关节、心脏等多组织器官损伤的疾病，又称莱姆疏螺旋体病(Lymeborreliosis)。莱姆病的主要病原体为伯氏疏螺旋体，主要分为三个亚型：狭义伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferisensuestricto)，嘎氏伯氏疏螺旋体(Borreliaafzelii)和伽氏伯氏疏螺旋体(Borreliagarinii)。莱姆病菌株在我国也分为三种基因型，其中B.burgdorferisensuestricto、B.afzelii、B.garinii基因种比率分别为5.81％、23.26％、66.28％。莱姆病在美国以及欧洲，尤其是斯堪的纳维亚半岛以及中欧地区为其高发地区；在中国，莱姆病的发病主要分布在山区以及林区，儿童发病率高于成人。环形游走性红斑(Erythemamigrans，EM)是莱姆病早期典型症状，未经治疗的莱姆病病人在病情发展的数月到数年之间会发生神经性病变，外周神经以及中枢神经都将受累，导致神经性莱姆病(neuroborreliosis,NB)。但是由于莱姆病感染初期的临床表现的非特异性，即其环形游走性红斑的表现与诸多皮肤性疾病有类似及重叠的表现，以及临床医生对莱姆病的危害认识不足等原因，导致莱姆病易在临床上误诊或漏诊。实验研究表明宿主动物对三种基因型伯氏疏螺旋体感染引起的临床症状有所不同，狭义伯氏疏螺旋体主要引起与关节有关的疾病，嘎氏伯氏疏螺旋体主要引起皮肤疾病，伽氏伯氏疏螺旋体主要引起与神经系统有关的疾病等。目前用于实验室诊断伯氏疏螺旋体感染的方法包括细胞培养技术、免疫组织化学技术、聚合酶链反应以及用全细胞裂解液、重组蛋白和多肽进行的酶联免疫检测或者蛋白质印迹的血清抗体检测等技术。尽管如此，常规血清免疫方法在莱姆病诊断上的价值仍然存在着诸多问题。美国国家疾控中心推荐莱姆病检测的首选方法是用ELISA或者直接免疫荧光法对血清中疏螺旋体产生的抗体的检测，但是结果仍需要免疫印迹方法的确证。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种琥珀酰-β-环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供了一种用于莱姆病检测的蛋白质芯片，包括固相载体和固定于所述固相载体上的捕获分子，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)。优选地，所述固定为点阵固定。优选地，所述固相载体为金箔芯片。本专利技术的优选实施例中所采用的金箔芯片的基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm。进一步优选地，所述固相载体为表面依次修饰有16-氨基-1-十六烷硫醇和琥珀酰-β-环糊精的金箔芯片。优选地，琥珀酰-β-环糊精上由羧基活化而成的琥珀酰亚胺基与金箔芯片上所修饰的16-氨基-1-十六烷硫醇中的氨基结合。优选地，伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)与琥珀酰-β-环糊精结合。优选地，所述固相载体上伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的密度范围是：3.9x10-4ng/mm2～0.41ng/mm2。进一步优选地，所述固相载体上伯氏疏螺旋体表面蛋白VlsE的密度范围是：1.3x10-2ng/mm2～0.41ng/mm2。本专利技术的第二方面，提供了上述用于莱姆病检测的蛋白质芯片中固相载体的制备方法，包括步骤：(1)将琥珀酰-β-环糊精上的羧基活化为琥珀酰亚胺基，获得活化后的琥珀酰-β-环糊精；(2)在金箔芯片上修饰16-氨基-1-十六烷硫醇，获得16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片；(3)在步骤(2)中所得16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片上修饰步骤(1)所得活化后的琥珀酰-β-环糊精，获得固相载体。优选地，步骤(1)中，采用EDC和NHS对琥珀酰-β-环糊精上的羧基进行活化。本专利技术的第三方面，提供了上述用于莱姆病检测的蛋白质芯片的构建方法，包括步骤：将捕获分子进行稀释，获得捕获分子溶液；采用常规方法将捕获分子溶液分别点阵于固相载体表面的不同位置，并固定。本专利技术的第四方面还提供了前述用于莱姆病检测的蛋白质芯片在制备伯氏疏螺旋体检测试剂盒中的用途。本专利技术的第五方面提供了一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，所述试剂盒包括前述用于莱姆病检测的蛋白质芯片。优选地，所述伯氏疏螺旋体检测试剂盒中还含有阴性对照。所述阴性对照是PBST-BSA溶液或阴性血清。所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M的磷酸盐缓冲液PBS(PH7.2-7.4)；0.1％(v/v)Tween20；0.1％(w/v)胎牛血清BSA混合构成。所述阴性血清为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人的血清。优选地，所述伯氏疏螺旋体检测试剂盒中还含有阳性对照。所述的阳性对照选用人免疫球蛋白IgG、IgM或阳性血清。所述的阳性血清是临床确诊的伯氏疏螺旋体感染患者的血清。特殊抗原和金箔芯片的选用是本专利技术蛋白质芯片的关键创新点。基于本专利技术的所述试剂盒采用的是荧光方法来进行检测，所以试剂盒中还可以包括其他一些试剂。例如：标准品，稀释液，清洗液中的一种或多种。具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。所述标准品包括伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的IgG或IgM抗体。优选地，所述的试剂盒还包括荧光素标记的IgG二抗、荧光素标记的IgM二抗。优选地，所述荧光素标记为Cy3标记或Cy5标记。优选地，所述试剂盒中还含有稀释液PBST-BSA溶液。所述稀释液可用于稀释抗原、抗体、血清等。所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M的磷酸盐缓冲液PBS(PH7.2-7.4)；0.1％(v/v)Tween20；0.1％(w/v)胎牛血清BSA混合构成。本专利技术的第六方面还提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：将血清样本点于前述蛋白质芯片上，孵育，清洗，再点加荧光素标记的IgG二抗和荧光素标记的IgM二抗混合溶液。清洗用于将未完全反应的血清从芯片上除去，可选用本领域常规的用于抗原抗体反应的洗液。优选地，可选用PBST(pH7.4)作为洗液。优选地，清洗时，PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。优选地，所述荧光素标记的IgG二抗为Cy3标记的IgG抗体。更优选为Cy3标记驴抗人IgG抗体。优选地，所述荧光素标记的IgM二抗为Cy5标记的IgM抗体。更优选为Cy5标记山羊抗人IgM抗体。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)一方面本专利技术利用金箔作为基质。其与传统玻璃片、硅片以及高分子材料基质的优势在于，金箔本身为惰性金属，但其与化学物质的结合与传统玻璃片和硅片相比来说更加牢固。并且金箔的生物亲和度较低，不易与基因或者蛋白质等物质产生非特异性吸附，大大降低了非特异性，避免了检测结果假阳性的产生。(2)在用于实际检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于莱姆病检测的蛋白质芯片，包括固相载体和固定于所述固相载体上的捕获分子，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)。

【技术特征摘要】
1.一种用于莱姆病检测的蛋白质芯片，包括固相载体和固定于所述固相载体上的捕获分子，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)；所述固相载体为表面依次修饰有16-氨基-1-十六烷硫醇和琥珀酰-β-环糊精的金箔芯片；琥珀酰-β-环糊精上由羧基活化而成的琥珀酰亚胺基与固相载体上所修饰的16-氨基-1-十六烷硫醇中的氨基结合；伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)与琥珀酰-β-环糊精结合。2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述固相载体上伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的密度范围是：3.9x10-4ng/mm2～0.41ng/mm2。3.根据权利要求1～2任一权利要求所述用于莱姆病检测的蛋白质芯片中固相载体的制备方法，包括步骤：(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜卫东，黄娜丽，叶雷，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34