位点特异性蛋白质修饰制造技术

本发明专利技术涉及用于位点选择性修饰蛋白质和肽的方法和试剂。位点选择性修饰是利用近邻组氨酸氨基酸的存在增加N末端氨基官能团的反应性，选择性衍生在蛋白质或多肽的N末端的氨基官能团。通过本发明专利技术方法获得的修饰的蛋白质或肽可以用于成像检查或治疗性用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术一般地涉及向蛋白质或多肽引入修饰基团的新方法。具体地说，本专利技术涉及利用近邻组氨酸氨基酸的存在增加N末端氨基官能团的反应性，选择性衍生在蛋白质或多肽的N末端的氨基官能团。专利技术背景熟知可以通过使基团缀合至蛋白质或肽修饰蛋白质或肽的特性和特征。通常，这类缀合通常需要蛋白质中的一些官能团与缀合基团中的另一个官能团反应。氨基，如赖氨酸残基中的N末端氨基或ε-氨基，已经为此目的与合适的酰化试剂组合使用。经常想要或必需控制缀合反应，如在缀合化合物与连接蛋白质的情况下和控制连接多少缀合基团。这经常称作特异性或选择性。蛋白质或肽的位点特异性修饰是药物和生物
的长期挑战。经典方法经常导致非特异性标记(例如NHS标记)或需要工程化(例如马来酰亚胺Cys标记或非天然氨基酸)。此外，选择性化学反应的总数然而非常有限。一个备选是通过重组方法，引入具有独特反应性的特定非天然氨基酸并且随后在其他衍生化中利用这种反应性。另一个备选是使用识别待修饰蛋白质的结构特征和功能特征的酶。尽管采用重组方法，蛋白质/肽的选择性衍生化仍是非常困难的任务。因此，本领域需要如在蛋白质或肽的N末端选择性衍化氨基酸残基的一般方法。专利技术简述本专利技术涉及一种在N末端氨基酸的氨基官能团修饰靶蛋白或靶肽的方法，所述方法包括步骤：a.修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；并且b.使在与N末端氨基酸毗邻的位置处含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽与酰化化合物在低于6的pH接触，以形成修饰的蛋白质或多肽。本专利技术还涉及用于修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的多种方法。这类方法将在本文中更详细地描述。在另一个实施方案中，本专利技术涉及一种在N末端氨基酸的氨基官能团修饰靶蛋白或靶肽的方法，所述方法包括步骤：a.修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；并且b.使在与N末端氨基酸毗邻的位置处含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽与以下式的活化形式的酸在低于6的pH接触：HO-C(O)-(L1)n-R1，其中：L1是接头；R1是包含促进与生物相互作用剂或与分析剂共价接合的反应基团的部分或R1是生物相互作用剂或分析剂，n是0或1，以形成修饰的蛋白质或肽。在另一个实施方案中本专利技术涉及使用下式的酰化剂修饰如上文描述的靶蛋白或靶肽的选择性方法：其中：L1是接头；R是H或-S(O)2Na；R1是包含促进与生物相互作用剂或与分析剂共价接合的反应基团的部分或R1是生物相互作用剂或分析剂，n是0或1。在前述实施方案的又一个方面，本专利技术涉及如本文所述在N末端氨基处修饰蛋白质或肽的选择性方法，其中生物相互作用剂或分析剂选自生物素、荧光团、毒素、螯合剂、延长半寿期的部分(如例如白蛋白结合部分、Fc变体或天然Fc)、成像试剂和肽。在另一个实施方案中，本专利技术涉及如本文所述在N末端氨基处修饰蛋白质或肽的选择性方法，其中R1是包含促进与生物相互作用剂或分析剂共价接合的反应基团的部分。反应基团的例子是酰基、酯或混合酐、炔、四嗪、马来酰亚胺、亚氨酸酯、羧基或更一般地能够与生物相互作用剂或分析剂中存在的官能团如氨基、叠氮基、烯基、硫醇基或肼、羟胺基形成共价键的基团。在这个实施方案的一个特定方面，本专利技术的方法还包括步骤：使生物相互作用剂或分析剂与酰化剂中存在的反应基团反应，其中生物相互作用或生物分析剂借助官能团(任选地借助接头L2)反应。接头将在本文中更详细地定义。在一个实施方案中，靶蛋白质或靶肽选自生长分化因子15(GDF15)蛋白、同源物、变体、片段和其其他修饰形式、天然Fc、Fc变体或APJ激动剂肽。本专利技术的这些和其他方面将在本专利技术的以下详细说明中阐明。附图简述专利技术详述定义：出于解释本说明书的目的，除非另外指定，否则以下定义将适用，并且在适宜的任何时候，以单数使用的术语也将包括复数形式并且反之亦然。为了并入本文中，对专利、专利出版物和其他文献所做的全部参考均进行至法律允许的程度。通过提供一种以选择性方式向靶蛋白或肽引入修饰化合物的方法，本专利技术解决了前述需求。必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数称谓。因此，例如，对“缀合物”的称谓包括对一种或多种缀合物的称谓；对“多肽”的称谓包括对一种或多种多肽的称谓等。术语烷基指包含1至30个碳原子的完全饱和分枝或不分枝(或直链或线性)的烃部分。优选地，烷基包含5至20个碳原子并且更优选地10至15个碳原子。C10-15烷基指包含10至15个碳的烷基链。术语“烯基”指具有至少一个碳-碳双键的分枝或不分枝的烃。术语“C2-30-炔基”指具有2至7个碳原子并且包含至少一个碳-碳叁键的烃。术语“炔基”指具有至少一个碳-碳参键的分枝或不分枝的烃。术语“C2-30-炔基”指具有2至7个碳原子并且包含至少一个碳-碳叁键的烃。术语芳基指在环部分中具有6-10个碳原子的单环状或双环状芳烃基。芳基的代表性例子是苯基或萘基。术语杂芳基包括含有5-10个选自碳原子和1至5个杂原子的环成员的单环或双环杂芳基，并且每个杂原子独立地选自O、N或S，其中S和N可以氧化成多种氧化状态。对于双环杂芳基系统，该系统是完全芳族的(即全部环均是芳族的)。术语环烷基指3-12个碳原子、优选地3-8个或3-7个碳原子的饱和或不饱和、但非芳族单环、双环或三环烃基。对于双环和三环环烷基系统，全部环是非芳族的。例如，环烷基涵盖环烯基和环炔基。术语“环烯基”指具有至少一个碳-碳双键的3-12个碳原子的双环或三环烃基。术语“环炔基”指具有至少一个碳-碳叁键的3-12个碳原子的双环或三环烃基。术语杂环基指含有至少一个选自O、S和N的杂原子的饱和或不饱和非芳族(部分不饱和的但是非芳族)单环、双环或三环环系统，其中N和S还可以任选地氧化成多种氧化状态。在一个实施方案中，杂环基部分代表含有5-7个环原子和任选地含有选自O、S或N的其他杂原子的饱和单环状环。杂环可以用烷基、卤素、氧代、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基取代。在其他实施方案中，杂环基为双环或三环。对于多环系统，一些环可以是芳族的并且与饱和或部分饱和的环或多个环稠合。总体的稠合系统并不是完全芳族的。例如，杂环系统可以是与饱和或部分饱和的环烷基环系统稠合的芳族杂芳基。术语“缀合物”意指因靶蛋白/肽与生物相互作用剂/分析剂共价接合、任选地经接头共价接合所形成的实体。术语“缀合”意指靶蛋白/肽与生物相互作用剂/分析剂共价接合、任选地经接头共价接合的步骤。如本文所用，术语“多肽”指由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是否为天然或合成地产生。小于约10个氨基酸残基的多肽常称作“肽”。术语“肽”意在表示由肽键连接的两个或更多个氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然或非天然的。本术语涵盖术语多肽和蛋白质，所述多肽和蛋白质可以由借助共价相互作用(例如半胱氨酸桥或非共价相互作用)结合在一起的两个或更多个肽组成。本领域认可的三字母或单字母缩写用来代表构成本专利技术肽和多肽的氨基酸残基。除前置“D”时，氨基酸是L-氨基酸。当单字母缩写是大写字母时，它指D-氨基酸。当单字母缩写本文档来自技高网...

【技术保护点】
在N末端氨基酸的氨基官能团修饰靶蛋白或靶肽的方法，所述方法包括步骤：a.修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；b.使在与N末端氨基酸毗邻的位置处含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽与酰化化合物在低于6的pH接触，以形成修饰的蛋白质或肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.23 US 62/015,868;2014.11.20 US 62/082,3371.在N末端氨基酸的氨基官能团修饰靶蛋白或靶肽的方法，所述方法包括步骤：a.修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；b.使在与N末端氨基酸毗邻的位置处含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽与酰化化合物在低于6的pH接触，以形成修饰的蛋白质或肽。2.权利要求1的方法，其中通过将与所述靶蛋白或靶肽的N末端氨基酸毗邻的氨基酸替换为组氨酸氨基酸，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的所述蛋白质或肽。3.权利要求1的方法，其中通过将在所述靶蛋白或靶肽的N末端的两个氨基酸替换为氨基酸序列XH-，其中H是组氨酸并且X是选自M、A、Q、N和G的氨基酸，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽。4.根据权利要求3的方法，其中氨基酸序列XH-是MH-或AH-。5.权利要求1的方法，其中通过将在所述靶蛋白或靶肽的N末端的三个氨基酸替换为氨基酸序列XHX’-，其中H是组氨酸并且X和X’是独立地选自M、A、Q、N和G的氨基酸，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽。6.根据权利要求5的方法，其中氨基酸序列XHX’-选自AHA-和MHA。7.权利要求1的方法，其中通过在所述靶蛋白或靶肽的N末端附加式XH的两氨基酸序列或式XHX’-的三氨基酸序列，其中H是组氨酸并且X和X’独立选自M、A、Q、N和G，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽。8.权利要求1的方法，其中通过在所述靶蛋白或靶肽的N末端附加组氨酸标签，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽。9.根据权利要求8的方法，其中通过附加选自MHHHHHH-或MHHHHHHM-的氨基酸序列至所述靶蛋白或靶肽的N末端，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽。10.权利要求1至9中任一项的方法，其中酰化剂是以下式的活化形式的酸：HO-C(O)-(L1)n-R1，其中：L1是接头；R1是包含促进与生物相互作用剂或与分析剂共价接合的反应基团的部分或R1是生物相互作用剂或分析剂，n是0或1。11.权利要求10的方法，其中酰化剂具有以下式：R是H或SO3Na。12.根据权利要求10或11的方法，其中n是1，L1包含一个或多个烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或一个或多个天然或非天然氨基酸，或其组合，其中烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·R·尤塞拉，袁骏，C·娄，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH