本发明专利技术涉及一种抗鸭病毒性肝炎(DVH)黄芪多糖磷酸化分子修饰法，属于中兽药制备技术领域。提取黄芪多糖不同醇沉部分，经反复临床试验筛选出抗DVH黄芪多糖有效部位，再用正交法确定三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰黄芪多糖有效部位的最佳条件为：反应温度70℃，反应时间4h，pH8.5；经红外光谱分析所得产物为黄芪多糖磷酸酯，其糖含量达36.87％，磷酸根含量达12.03％，产物得率达130.32％。黄芪多糖有效部位磷酸酯抗DHV-1感染鸭胚肝细胞作用和对DVH的疗效优于黄芪多糖有效部位。本发明专利技术所获得的抗DVH黄芪多糖有效部位磷酸酯具有较高的糖和磷酸根含量，及较高产物得率，对DVH有良好疗效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于中兽药制备技 术领域。 二、
技术介绍
鸭病毒性肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)感染引起的一种传播迅速、高发病率、高致死性 疫病。1949年首次分离到该病毒，目前已呈全世界范围分布。DHV主要存在DHV-I及其变异 株、Duck Astrovirus以及DHV-3三个血清型，其中DHV-I型毒性最强、分布最广，主要侵染3 周龄以内的雏鸭，病死率高于80%，甚至可高达100%，是严重危害养鸭业主要病原之一。 目前，世界范围内临床上还没有有效的抗DHV-I药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射 弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现，即造成难以挽回的损失。1958年Gerber等首先发 现海藻多糖具有抗病毒作用，此后多种多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陆续被报道。近年 来，本实验室也发现了黄芪、香菇、当归等多种中药多糖能显著抵抗新城疫、传染性法氏囊 病等病毒的感染。中药化合物结构修饰是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。许多 学者发现，中药多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化分子修饰后，使其成酯化物，其水溶 性普遍增加，免疫药理作用明显增强。 黄芪是一种经典的补气用中药。大量的现代药理学研究和普遍的临床应用结果表 明，黄芪多糖是其主要有效成分之一，具有良好的提高免疫的作用。虽然有学者发现，经过 硫酸化修饰的硫酸化黄芪多糖对鸡传染性法氏囊病毒、猪繁殖呼吸综合征病毒和猪圆环病 毒等表现出良好的抑制作用。我们课题组发现，按照不同的条件修饰中药多糖所获得的多 糖成分分子修饰物的活性往往大相径庭。为研究有效的抗鸭病毒性肝炎药物，我们根据前 期的预试验，将分离获得并经在体试验验证有一定效果的黄芪多糖最有效部位采用磷酸化 分子修饰，并利用正交试验比较优化了其制备工艺，以进一步提高其生物活性和生物利用 率。 本专利技术首次对黄芪多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位进行筛选和磷酸化分子修饰，并 采用正交法优化了抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖活性部位磷酸化分子修饰条件，发现磷酸化分 子修饰能显著增加黄芪多糖有效部位抗鸭病毒性肝炎效果，提高其生物利用度，并获得较 高的产物得率。 三、
技术实现思路
技术问题本专利技术针对世界范围内临床上还没有有效的抗鸭病毒性肝炎药物问题， 提供一种黄芪多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位的磷酸化分子修饰方法，所获得的黄芪多糖磷 酸酯PAPS 75含量达36.87 %，磷酸根含量为12.03 %，产物得率达130.32 %，且对鸭病毒性肝 炎的治疗作用明显提高，可望最终应用于鸭病毒性肝炎的防治。 技术方案 采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位黄芪多糖，经数次临床试验发现黄芪多糖乙 醇浓度75 %醇沉部分(APS75)对鸭病毒性肝炎有较理想的治疗效果，再用正交试验法对 APS75的磷酸化分子修饰方法进行优化。经优化后的黄芪多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位 (APS75)的磷酸化分子修饰方法为:精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0 OOOg三偏磷酸钠，溶 于50ml蒸馏水中；精密称取250mg黄芪多糖有效部位APS75加入至100mL蒸馏水中，充分溶解 后将配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH = 7.5~9，置恒温水浴锅内， 反应温度70°C~90 °C、反应时间4~8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸 馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化黄芪多糖。经Nicolet FT-IR 200型傅立叶变换红外光 谱仪分析为黄芪多糖磷酸酯pAPS75。按此方法制备的黄芪多糖磷酸酯含量达36.87%，磷酸 根含量为12.03%，产物得率达130.32%。所获得的黄芪多糖磷酸酯对鸭肝炎病毒DHV-I感 染体外培养的鸭胚肝细胞具有良好的抑制作用，对鸭肝炎病毒DHV-I攻毒感染引起的鸭病 毒性肝炎具有良好的治疗作用，且其作用均优于未修饰的黄芪多糖APS75。 有益效果 病毒性疾病已经成为目前人类和动物健康的最大威胁之一，并造成了巨大的社会 经济损失。近年来肆虐人类的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、肠道病毒EV71型等等，肆虐 动物的禽流感、新城疫、蓝耳病、圆环病毒2型、伪狂犬病、细小病毒病、鸭病毒性肝炎等等， 都使人类和动物生命健康遭受了严重的威胁。病毒性疾病肆虐人畜的一个重要原因是人类 对于这些烈性病毒目前尚没有临床特效的药物。曾今的抗流感病毒特效药"达菲"现在对 H5N1、H7N9却不再那么有效。虽然三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、无环鸟苷等抗病毒药对病毒 病也有一定的临床疗效，但是其引起的恶心、精神素乱、腹与、肝肾功能损伤、眩晕等等不良 反应利药物残留，这些医源性、药源性疾病的不断增加使得人们开始拒绝这些抗病毒西药， 转而选择毒副作用小的中草药，目前已有40%以上的消费者选择了中药或中西结合治疗。 而在养殖业中，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一，随着金刚烧胺、利巴韦 林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。由于 世界范围内临床上尚还没有有效的抗DHV-I药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行 免疫防御。临床病例一旦出现3周龄以内的感染雏鸭，其病死率往往高于80%，甚至可高达 100%，造成的损失难以估量。黄芪多糖是黄芪的主要药效成分，具有良好的抗病毒、提高免疫等作用，目前已经 开发成为兽医临床用抗病毒药物和提高免疫用药物。广泛的兽医临床试验发现，黄芪多糖 对猪圆环病毒、繁殖呼吸综合征病毒、鸡传染性法氏囊病毒等有较好的疗效，但对鸭病毒性 肝炎、鸡新城疫等瘟疫疗效却不稳定。已有的研究发现黄芪多糖硫酸化分子修饰物具有更 良好的抗病毒作用，但硫酸化分子修饰操作相对复杂，刺激性大，修饰物水溶性欠佳，生物 利用度也有限。为研制有效的抗鸭病毒性肝炎治疗用药，并提高黄芪多糖的水溶性和生物 利用度，本专利技术采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰黄芪多糖抗鸭病毒性肝炎 有效部位APS 75,所形成的黄芪多糖磷酸酯PAPS75不仅磷酸根和磷酸酯多糖含量高，产物得 率亦很高，临床试验发现其对鸭病毒性肝炎的疗效明显增强，且水溶性良好，制剂使用更为 方便。 与现有技术相比，本专利技术优点如下： 1.多糖磷酸化分子修饰的方法国内虽有3篇报道.黑龙江大学自然科学学报，2013，30(5):664-670; 2.孙 雪，潘道东，曾小群，曹锦轩.浒苔多糖的磷酸化修饰工艺.食品科学，2011，32(24): 73-77;3.张难，吴远根，莫莉萍，邱树毅，王文平.香菇多糖磷酸化修饰工艺条件的研究.食 品与发酵工业，2007，33(12): 63-67]，但此3文并不是对黄芪多糖进行修饰，更不是对有效 作用部位进行修饰，所选的工艺方法为响应面法，本法采用的正交筛选，获得的最佳修饰条 件也不同。且最根本的在于本专利技术所修饰的黄芪多糖为抗鸭病毒性肝炎有效部位APS 75，目 前国内外尚未见相似研究。 2.通过本专利技术实施所获得的黄芪多糖磷酸酯PAPS75含量达36.87%，磷酸根含量为 12.03%，产物得率达130.32%，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制剂使用方便。 3.通过本专利技术实施所获得的黄芪多糖磷酸酯PAPS75不仅对鸭肝炎病毒DHV-I感染 体外培养的鸭胚肝细胞作用显著优于未修饰黄芪本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰法，采用三聚磷酸钠‑三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰黄芪多糖，其特征在于：(1)采用水煎醇沉法，收集了5个不同醇沉部位的黄芪多糖添加于饮水中治疗鸭肝炎病毒DHV‑1攻毒鸭，数次临床试验发现5个醇沉部位的黄芪多糖对鸭病毒性肝炎具有不同的治疗作用，以黄芪多糖75％醇沉部分APS75对鸭病毒性肝炎的治疗效果较好；(2)抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰的方法：精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg黄芪多糖有效部位APS75加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠‑三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化黄芪多糖。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘家国，王艺璇，陈云，熊文，王德云，武毅，胡元亮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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