【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及制备经工程化以表达嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞(例如t细胞或nk细胞)的方法，以及包含该免疫效应细胞的组合物。序列表本申请含有符合wipo标准st.26的按xml格式以电子方式提交的序列表，并将该序列表通过引用以其全文特此并入。所述xlm副本创建于2022年8月15日，名称为n2067-7191wo.xml并且大小为962.9kb。
技术介绍
1、使用t细胞(特别是用嵌合抗原受体(car)转导的t细胞)的过继性细胞转移(act)疗法在几项血液癌症试验中显示出前景。目前，基因修饰的t细胞的制造是一个复杂的过程。存在对改善表达car的细胞疗法产品的产生、提高产品质量和使产品的治疗功效最大化的方法和程序的需求。
技术实现思路
1、本披露关于制备经工程化以表达car的免疫效应细胞(例如t细胞或nk细胞)的方法，以及使用此类方法生成的组合物。还披露了使用此类组合物用于治疗受试者的疾病(例如癌症)的方法。
2、在一些方面，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(car)的细胞(例如，t细胞)群体的方法。方法包括：(i)使细胞(例如t细胞，例如从冷冻或新鲜的白细胞单采产物中分离的t细胞)群体与包含(a)抗cd3结合结构域，以及(b)共刺激分子结合结构域(例如，抗cd2结合结构域或抗cd28结合结构域)，以及(c)包含以下的fc区的多特异性结合分子接触(例如结合)：l234a、l235a、s267k、和p329a突变(lalaskpa)，其根据eu编号系统进行编号
3、在一些方面，本披露提供了多特异性结合分子，该多特异性结合分子包含(a)抗cd3结合结构域、(b)共刺激分子结合结构域(例如，抗cd2结合结构域或抗cd28结合结构域)；以及任选地(c)包含以下的fc区：l234a、l235a、s267k、和p329a突变(lalaskpa)，其根据eu编号系统进行编号；l234a、l235a、和p329g突变(lalapg)，其根据eu编号系统进行编号；g237a、d265a、p329a、和s267k突变(gadapask)，其根据eu编号系统进行编号；l234a、l235a、和g237a突变(lalga)，其根据eu编号系统进行编号；d265a、p329a、和s267k突变(dapask)，其根据eu编号系统进行编号；g237a、d265a、和p329a突变(gadapa)，其根据eu编号系统进行编号；或l234a、l235a、和p329a突变(lalapa)，其根据eu编号系统进行编号。
4、在一些实施例中，抗cd3结合结构域(例如，抗cd3 scfv)位于共刺激分子结合结构域的n末端，例如，抗cd2 fab或抗cd28 fab。在一些实施例中，抗cd3结合结构域(例如，抗cd3 scfv)位于共刺激分子结合结构域的c末端，例如，抗cd2 fab或抗cd28 fab。在一些实施例中，fc区包含ch2。在一些实施例中，fc区包含ch3。在一些实施例中，fc区位于抗cd3结合结构域和共刺激分子结合结构域之间。在一些实施例中，抗cd3结合结构域位于ch2的c末端。在一些实施例中，抗cd3结合结构域位于ch2的n末端。
5、在本文所述的组合物和方法的一些实施例中，多特异性结合分子包含：(i)从n末端至c末端包含以下的第一多肽：该抗cd3结合结构域的vh、该抗cd3结合结构域的vl、该共刺激分子结合结构域的vh、ch1、ch2、和ch3；和(ii)从n末端至c末端包含以下的第二多肽：该共刺激分子结合结构域的vl和cl。在一些实施例中，多特异性结合分子包含：(i)从n末端至c末端包含以下的第一多肽：该共刺激分子结合结构域的vh、ch1、ch2、ch3、该抗cd3结合结构域的vh、和该抗cd3结合结构域的vl；和(ii)从n末端至c末端包含以下的第二多肽：该共刺激分子结合结构域的vl和cl。在一些实施例中，多特异性结合分子包含：(i)从n末端至c末端包含以下的第一多肽：该共刺激分子结合结构域的vh、ch1、该抗cd3结合结构域的vh、该抗cd3结合结构域的vl、ch2、和ch3；和(ii)从n末端至c末端包含以下的第二多肽：该共刺激分子结合结构域的v本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中：
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述Fc区包含CH2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含CH3。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗CD3结合结构域位于所述Fc区的C末端。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗CD3结合结构域位于所述Fc区的N末端。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述Fc区位于所述抗CD3结合结构域和所述共刺激分子结合结构域之间。
8.如权利要求1-4或6中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合分子包含：
9.如权利要求1-5或7中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合分子包含：
10.如权利要求1-4或6中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合分子包含：
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述抗CD3结合结构域包含scFv，并且所述共刺
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述抗CD3结合结构域包含：
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子结合结构域是抗CD2结合结构域，任选地其中所述抗CD2结合结构域包含：
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子结合结构域是抗CD28结合结构域，任选地其中所述抗CD28结合结构域包含：
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述抗CD3结合结构域包含：
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子结合结构域是Fab片段的一部分，例如，Fab片段是包含所述Fc区的多肽序列的一部分。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述抗CD3结合结构域位于所述共刺激分子结合结构域的N末端，任选地其中所述抗CD3结合结构域通过肽接头，例如甘氨酸-丝氨酸接头，例如(G4S)4接头与所述共刺激分子结合结构域连接。
18.如权利要求1-7或9-17中任一项所述的方法，其中所述抗CD3结合结构域位于所述共刺激分子结合结构域的C末端。
19.如权利要求18所述的方法，其中：
20.如权利要求18所述的方法，其中：
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中与通过除不包括步骤(i)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中表达CAR的细胞的百分比，例如来自步骤(iii)的细胞群体显示更高百分比(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)的表达CAR的细胞。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中：
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中：
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中：
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中：
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中：
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中：
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中例如如使用在实例8中结合图29C-29D描述的方法进行评估，与通过其他方面类似的方法制备的细胞相比，在所述其他方面类似的方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他方面类似的方法制备的细胞相比，所述其他方面类似的方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由CAR识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌IL-2。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种制备表达嵌合抗原受体(car)的细胞(例如t细胞)群体的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中：
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述fc区包含ch2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述fc区包含ch3。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗cd3结合结构域位于所述fc区的c末端。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗cd3结合结构域位于所述fc区的n末端。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述fc区位于所述抗cd3结合结构域和所述共刺激分子结合结构域之间。
8.如权利要求1-4或6中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合分子包含：
9.如权利要求1-5或7中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合分子包含：
10.如权利要求1-4或6中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合分子包含：
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述抗cd3结合结构域包含scfv，并且所述共刺激分子结合结构域是fab片段的一部分。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述抗cd3结合结构域包含：
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子结合结构域是抗cd2结合结构域，任选地其中所述抗cd2结合结构域包含：
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子结合结构域是抗cd28结合结构域，任选地其中所述抗cd28结合结构域包含：
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述抗cd3结合结构域包含：
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子结合结构域是fab片段的一部分，例如，fab片段是包含所述fc区的多肽序列的一部分。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述抗cd3结合结构域位于所述共刺激分子结合结构域的n末端，任选地其中所述抗cd3结合结构域通过肽接头，例如甘氨酸-丝氨酸接头，例如(g4s)4接头与所述共刺激分子结合结构域连接。
18.如权利要求1-7或9-17中任一项所述的方法，其中所述抗cd3结合结构域位于所述共刺激分子结合结构域的c末端。
19.如权利要求18所述的方法，其中：
20.如权利要求18所述的方法，其中：
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中与通过除不包括步骤(i)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中表达car的细胞的百分比，例如来自步骤(iii)的细胞群体显示更高百分比(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)的表达car的细胞。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中：
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中：
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中：
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中：
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中：
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中：
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中例如如使用在实例8中结合图29c-29d描述的方法进行评估，与通过其他方面类似的方法制备的细胞相比，在所述其他方面类似的方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他方面类似的方法制备的细胞相比，所述其他方面类似的方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如t细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由car识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌il-2。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如t细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4c描述的方法进行评估)。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中与通过其他方面类似的方法制备的细胞相比，在所述其他方面类似的方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他方面类似的方法制备的细胞相比，所述其他方面类似的方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如t细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在被体内施用后显示出更强的抗肿瘤活性(例如在低剂量下具有更强的抗肿瘤活性，例如不超过0.15x 106、0.2x 106、0.25x 106、或0.3x 106个表达car的活细胞的剂量)。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％，任选地其中来自步骤(iii)的细胞群体中的活细胞数目较步骤(i)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含il-2、il-15(例如hetil-15(il15/sil-15ra))、il-7、il-21、il-6(例如il-6/sil-6ra)、lsd1抑制剂、malt1抑制剂、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含血清替代物的无血清细胞培养基中进行。
35.如权利要求30所述的方法，其中所述血清替代物是ctstm免疫细胞血清替代物(icsr)。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：接受从来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的t细胞)中分离的冷冻保存的t细胞。
38.如权利要求1-36中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，所述方法进一步包括步骤(vi)：
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中步骤(ii)进一步包括在转导期间添加f108和/或使细胞(例如t细胞)群体与靶向tet2的shrna接触。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体已经富集了表达il6r的细胞(例如对il6rα和/或il6rβ呈阳性的细胞)。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体包含不少于50％、60％、或70％的表达il6r的细胞(例如对il6rα和/或il6rβ呈阳性的细胞)。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中步骤(i)和(ii)或步骤(1)和(2)在包含il-15(例如hetil-15(il15/sil-15ra))的细胞培养基中进行。
44.如权利要求43所述的方法，其中例如10、15、20、或25天后，il-15增加所述细胞群体扩增的能力。
45.如权利要求43所述的方法，其中il-15增加所述细胞群体中表达il6rβ的细胞的百分比。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述car包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述抗原结合结构域与选自以下的抗原结合：cd19、cd20、cd22、bcma、间皮素、egfrviii、gd2、tn抗原、stn抗原、tn-o-糖肽、stn-o-糖肽、psma、cd97、tag72、cd44v6、cea、epcam、kit、il-13ra2、leguman、gd3、cd171、il-11ra、psca、mad-ct-1、mad-ct-2、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、叶酸受体α、erbb(例如erbb2)、her2/neu、muc1、egfr、ncam、肝配蛋白b2、caix、lmp2、sle、hmwmaa、邻乙酰基-gd2、叶酸受体β、tem1/cd248、tem7r、fap、豆荚蛋白、hpv e6或e7、ml-iap、cldn6、tshr、gprc5d、alk、多唾液酸、fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、trp-2、cyp1b1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、afp、甲状腺球蛋白、plac1、globoh、rage1、mn-ca ix、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70-2、na-17、ny...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·巴德罗夫，R·塞贝，B·W·格兰达，S·贾山卡尔，S·T·科希，S·米勒，A·P·普莱斯，A·雷奥，D·什凯格罗，L·M·特雷纳，J·杨，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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