涉及核酸-蛋白质复合物的组合物和方法技术

提供了涉及在维持蛋白质活性的条件下缀合核酸与目标蛋白质的方法和组合物。核酸-蛋白质缀合物可用于核酸纳米结构诸如使用DNA折叠法产生的那些核酸纳米结构中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2013年7月10日提交的标题为“COMPOSITIONSANDMETHODSRELATINGTONUCLEICACID-PROTEINCOMPLEXES”的美国临时申请号61/844,818的权益，其完整内容通过引用并入本文。联邦政府资助的研究本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的DC002281下由美国政府资助进行的。美国政府具有本专利技术的某些权利。专利技术背景DNA已成为所选择的用于构建自组装纳米结构的支架。随着用于这些结构的程序图形化的技术已取得进展，现在可能产生复杂的组装体(LinkoandDietz,Curr.Opin.Biotechnol.24:555-561,2013)。为了利用这些结构元件并将它们制成功能性纳米机器，常常需要在非常特异的位点上掺入蛋白质(Niemeyer,TrendsinBiotech20:395-401,2002)。遇到的阻碍是将目标蛋白质偶联于DNA的成功方法。常规用于将蛋白质连接于寡核苷酸(寡聚物)的化学过程包括二硫键联和硫醇-伯胺键联(CecconiC.等,Eur.Biophys.J.37(6):729-38,2008)；Halvorsen等,Nanotechnol.22:494005-494012,2011；NiemeyerandSacca,Chem.Soc.Rev.40:5910-5921,2011)。虽然这些化学过程有时是有效的，但它们与生物学中常见的官能团反应。因此当目标蛋白质具有内源半胱氨酸时或当想要附接于特定的伯胺(除了N末端以外，每个赖氨酸提供伯胺)时，不能使用这些技术。为了克服许多的这些问题，研究小组已着手开发生物正交技术诸如无铜点击化学(Gordon等，J.Am.Chem.Soc.134:9199-9208,2012)。虽然这些技术克服了特异性和化学计量的问题，但它们遭受面向所有3种技术的问题。所有这些技术需要在亚最佳的生理条件下进行反应。由于长期处于室温、氧化/还原条件或高/低pH条件下，当利用许多在这些条件下不是非常热稳定的并且具有聚集和/或从溶液沉淀出来的倾向的蛋白质进行作用时这些化学过程开始失效。除了关于这些化学过程的障碍以外，必需针对不同的蛋白质谨慎地改变条件，并且不存在选择性纯化出所需产物的方法。专利技术概述本公开内容部分地提供用于将核酸缀合于蛋白质的新型和稳健的方法，所述方法克服了现有技术的缺点。这些方法前置待对核酸(包括寡核苷酸)和小(通常合成的)肽进行的化学过程。这样的核酸和肽对于可用于进行本公开内容中涉及的某些化学过程的非生理条件通常是更加耐受的。本公开内容提供了两步法及其变型，其包括首先将核酸(例如，DNA)缀合于短的通常合成的肽，以形成核酸-肽缀合物，随后使用转肽酶(例如，分选酶)反应将核酸-肽缀合物缀合于目标蛋白质。两步法的至少一个有利方面是将蛋白质与不利的反应环境分离的能力，所述不利的反应环境可能降低所述蛋白质的活性。通过该两步法，在第一步骤中使用这些不利的反应条件，并在第二步骤中引入所述蛋白质。因此，在一些情况下，本公开内容的方法包括将核酸(诸如寡核苷酸)缀合于包含一个或多个连续的N-末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列包含3个连续的N末端甘氨酸残基。氨基酸序列通常被包含在短肽(通常为合成肽)中。N-末端GGG基序由本公开内容的方法中使用的分选酶识别。氨基酸序列还可包含可用于纯化目的的额外氨基酸序列。这些氨基酸序列在本文中可被称为纯化标签或亲和标记，并且包括但不限于His-标签和Flag序列(或Flag标签)，其氨基酸序列在本领域中是已知的并且提供于本文中。寡核苷酸至肽的缀合可使用例如生物正交铜催化点击化学反应来实现。待缀合于肽的寡核苷酸可包含叠氮化物。叠氮化物可位于3'末端或5'末端，或者它可以是内部的叠氮化物。待被缀合的肽可包含炔烃，其用作互补点击试剂。或者，所述肽可包含叠氮化物并且所述寡核苷酸可包含炔烃。应当理解，可使用其它缀合方法来实现核酸至肽的缀合。例如，该第一步骤还可使用磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)将胱氨酸(肽中的)偶联于胺官能化的寡核苷酸来实现。该第一反应步骤的所得产物是缀合于包含一个或多个(例如3个)甘氨酸残基和任选地纯化标签诸如(但不限于)Flag氨基酸序列的氨基酸序列(即，肽)的核酸(例如，寡核苷酸)。偶联于肽的核酸可以被移除(例如，与其它反应物分离)和任选地通过利用纯化标签从反应混合物中纯化。一种方法是使用珠粒诸如磁珠，或基于柱的珠浆体，其中的任一种包含结合纯化标签的针对纯化标签的结合伴侣(例如，所述结合伴侣可以是特异于所述纯化标签的抗体)。氨基酸序列还可含有额外的可切割序列。这样的序列可在酶存在的情况下或通过另一种机制被切割。这样，将缀合的核酸与其它反应物分离后，可从缀合的核酸除去纯化标签，只留下随后可接近第二步骤中所使用的分选酶的一个或多个(例如3个)末端甘氨酸残基。在一些实施方案中，酶可切割的氨基酸序列可由烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割。可由TEV蛋白酶切割的氨基酸序列的实例是包含ENLYFQ(SEQIDNO：1)的氨基酸序列。或者，可切割的序列可通过非酶促方法(例如，光)切割。可切割的序列通常位于纯化标签与一个或多个(例如3个)甘氨酸残基之间。在方法的第二步骤中，所得的缀合于一个或多个(例如，3个)末端甘氨酸残基的核酸随后与目标蛋白质反应。目标蛋白质可天然地含有还是分选酶或另一种转肽酶的靶序列的氨基酸序列，或者可选择地所述蛋白质可被工程化以含有这样的氨基酸序列。这些氨基酸序列在本文中可被称为分选酶(或转肽酶)靶序列。分选酶靶序列的一个实例为LPXTGX’n(SEQIDNO:2)，其中X和X’是独立选择的氨基酸，并且n为大于0的任何数值或任何数值的范围，包括例如1-90、1-99或1-100。X’n从而意欲表示所述氨基酸序列可在一个末端含有任意数目的氨基酸残基(即，n个数目的X’氨基酸残基，其中每个X’氨基酸残基独立地选自每个其它X’氨基酸残基，其中n可以为1-100，或1-99或1-90，或其间的任何数值)。一个这样的序列为LPETGX’n(SEQIDNO:3)，其中X’为氨基酸并且n为大于0的任何数值或任何数值的范围，包括例如1-90、1-99或1-100。术语本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含通过氨基酸接头共价地缀合于蛋白质的核酸的复合物，所述氨基酸接头具有LPXTGGG(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列，其中X为任意氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.07.10 US 61/844,8181.一种包含通过氨基酸接头共价地缀合于蛋白质的核酸的复合
物，所述氨基酸接头具有LPXTGGG(SEQIDNO:9)的氨基酸序列，
其中X为任意氨基酸。
2.权利要求1的复合物，其中所述蛋白质是天然存在的蛋白质并
且所述LPXTGGG(SEQIDNO:9)的氨基酸序列不存在于所述天
然存在的蛋白质中，其中X为任意氨基酸。
3.权利要求1或2的复合物，其中所述氨基酸序列为LPETGGG
(SEQIDNO:5)。
4.权利要求1-3的任一项的复合物，其中所述核酸在长度上为
1-100个核苷酸。
5.一种组合物，其包含分离形式的权利要求1-4的任一项的复合
物。
6.一种组合物，其包含以下的两种或更多种的任意组合：
缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸，
包含LPXTGX’n(SEQIDNO:2)的末端氨基酸序列的蛋白质，
其中X为任意氨基酸，X’n为长度n的一串独立选择的氨基酸，并且
n为大于0的数值或大于0的数值的范围，
分选酶，和
TEV蛋白酶。
7.权利要求6的组合物，其中所述末端氨基酸序列为LPETGX’n(SEQIDNO:3)，其中X’为氨基酸并且n为大于0的数值或大于0

\t的数值的范围。
8.权利要求6或7的组合物，其中将所述蛋白质、分选酶和TEV
蛋白酶的任一种或任意组合缀合于His-标签。
9.权利要求8的组合物，其中所述His-标签包含在X’n氨基酸序
列中。
10.权利要求6-9的任一项的组合物，其还包含特异性结合His-
标签的珠粒(抗-His珠粒)。
11.权利要求6-10的任一项的组合物，其中n为1至100、或1
至99、或1至90的任何数值或任何数值范围。
12.权利要求8-11的任一项的组合物，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·A·库萨，W·P·翁，
申请(专利权)人：哈佛学院院长及董事，儿童医学中心公司，
类型：发明
国别省市：美国;US