核酸信号放大序列及放大方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸信号放大序列及核酸信号放大方法。本发明专利技术所述核酸信号放大序列包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。本发明专利技术所述核酸信号放大序列可以通过前导序列将目的靶标捕获杂交，再经过若干倍数的重复序列结合相应的报告探针即可实现信号放大，从而检测到目的靶标的核酸信号。相对于PCR技术需要酶来维系杂交体系，本发明专利技术可以实现不增加检测物浓度的前提下实现核酸物质的检测，且稳定性好，重复性高，成本低，检测流程短。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸信号放大序列及核酸信号放大方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。但是，PCR技术的稳定性和重复性较差，存在严重的气溶胶污染缺陷，虽然后续的闭管荧光PCR解决了交叉污染的问题，但是仍没能解决PCR技术的天生缺陷问题。其次PCR成本较高，PCR反应需要建设较高的空气净化级别的专用实验室，对实验要分区管理，管理成本大大增加；而且反应时间流程太长导致每次检测的时间成本增加。此外，PCR反应中Taq酶或者聚合酶还容易受到样本中的物质影响，导致假阳性或者假阴性的结果出现。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷提供一种核酸信号放大序列及其制备方法，以及利用该序列进行核酸信号放大的方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案。一种核酸信号放大序列，包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。在一些实施方案中，本专利技术所述核酸信号放大序列中，所述前导序列的Tm值为55℃-62℃；所述重复序列的Tm值小于55℃。在一些实施方案中，本专利技术所述核酸信号放大序列中所述前导序列5’端还包括硫代三磷酸腺苷保护的限制性内切酶I酶切位点酶切后的片段，所述限制性内切酶I的酶切位点酶切后为粘性末端。进一步的，在一些实施方案中，本专利技术所述核酸信号放大序列中所述核酸信号放大序列3’端还包括限制性内切酶II的酶切位点酶切后的片段；所述限制性内切酶II的酶切位点酶切后为平整末端。在一些实施方案中，本专利技术所述核酸信号放大序列中，所述限制性内切酶I为EcoRI、BamH I、HindII、HindIII；所述限制性内切酶II为EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、HalIII、HPa I、Sma I。进一步的，在一些实施方案中，所述核酸信号放大序列中所述重复序列的倍数为5倍-20倍。本专利技术还提供了所述核酸信号放大序列的制备方法，具体包括以下步骤：A、根据目的靶标设计核酸信号前导序列和若干倍数的重复序列，并分别在前导序列5’端加上限制性内切酶I的酶切位点，在若干倍数的重复序列3’端加上限制性内切酶II的酶切位点；所述限制性内切酶I的酶切位点与核酸信号放大序列的前导序列相连，酶切后为粘性末端；所述限制性内切酶II的酶切位点与核酸信号放大序列的重复序列相连，酶切后为平整末端；B、合成序列插入载体后进行克隆复制；C、限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后，硫代三磷酸腺苷对限制性酶切末端进行保护；D、核酸外切酶III酶切获得核酸信号放大序列。其中，所述核酸信号放大序列的制备方法中，所述载体为pGEM-3ZF(+)载体。本专利技术还提供了一种核酸信号放大的方法，将含有目的靶标的样品包被在微孔板上，然后加入上述核酸信号放大序列杂交，之后加入报告探针杂交后加入化学发光底物读取结果。进一步的，在一些实施方案中，本专利技术所述核酸信号放大的方法还包括以核酸信号放大序列中的重复序列为前导序列进行次级信号放大的步骤。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种核酸信号放大序列及其制备方法，以及利用该序列进行核酸信号放大的方法。本专利技术所述核酸信号放大序列包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。本专利技术所述核酸信号放大序列可以通过前导序列将目的靶标捕获杂交，再经过若干倍数的重复序列结合相应的报告探针即可实现信号放大，从而检测到目的靶标的核酸信号。相对于PCR技术需要酶来维系杂交体系，本专利技术可以实现不增加检测物浓度的前提下实现核酸物质的检测，且稳定性好，重复性高，成本低，检测流程短。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示核酸信号放大序列结构示意图；图2示核酸外切酶III酶切获得核酸信号放大序列的示意图；图3示pGEM-3ZF(+)载体图谱；图4示初级信号放大加次级信号放大构象图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案。一种核酸信号放大序列，包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。本专利技术所述核酸信号放大序列为针对目的靶标设计并合成的一种非自然存在的基因序列，该基因序列是由一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成。其结构如图1所示。Tm值是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构在热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。本专利技术所述核酸信号放大序列中所述前导序列可以与目的靶标序列互补形成双螺旋结构。所述若干重复序列可以与报告探针序列互补形成双螺旋结构。为了保证结构的稳定，本专利技术所述核酸信号放大序列中所述前导序列的Tm值保证在60℃左右。在一些实施方案中，所述前导序列的Tm值为55℃-62℃。同样的，本专利技术所述核酸信号放大序列中所述核酸信号放大序列中所述重复序列的Tm值小于55℃，以确保重复序列的特异性杂交。如，在一些实施例中所述核酸信号放大序列中所述前导序列具体为ACGTTTTAGAGAGAGATATGAT，所述重复序列为TCCCGGGAGGCGAGCA。如，在一些实施例中所述核酸信号放大序列中所述前导序列具体为TCCCTGAATGCCTAACGAT，所述重复序列为AGGTCTTTACCACCAATATTCTTTT。在一些实施方案中，所述核酸信号放大序列中所述前导序列5’端还包括硫代三磷酸腺苷保护的限制性内切酶I酶切位点酶切后的片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸信号放大序列，包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。

【技术特征摘要】
1.一种核酸信号放大序列，包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。2.根据权利要求1所述的核酸信号放大序列，所述前导序列的Tm值为55℃-62℃；所述重复序列的Tm值小于55℃。3.根据权利要求1或2所述的核酸信号放大序列，所述前导序列5’端还包括硫代三磷酸腺苷保护的限制性内切酶I酶切位点酶切后的片段，所述限制性内切酶I的酶切位点酶切后为粘性末端。4.根据权利要求1-3任意一项所述的核酸信号放大序列，所述核酸信号放大序列3’端还包括限制性内切酶II的酶切位点酶切后的片段；所述限制性内切酶II的酶切位点酶切后为平整末端。5.根据权利要求1-4任意一项所述的核酸信号放大序列，所述限制性内切酶I为EcoRI、BamH I、Hind II、HindIII；所述限制性内切酶II为EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、HalIII、HPa I、Sma I。6.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸信号放大序列，所述重复序列的倍数为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹭鹭，李先坤，张爱国，
申请(专利权)人：科蒂亚新乡生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41