一种橡胶树HbAG基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种橡胶树HbAG基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还提供了该HbAG基因编码的蛋白及该HbAG基因的应用。本发明专利技术首次从橡胶树中克隆得到HbAG基因，该基因属于AG亚家族，参与花的发育、胚珠的形成和种子的成熟，执行D类基因功能。通过亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞核，符合转录因子的特征。进一步将该基因转到拟南芥中，获得转基因植株，发现转基因植株出现开花时间明显提前，营养生长时间短，及植株矮化等表型，表明该基因在橡胶树的花器官发育、以及生殖发育中起着重要的调控作用。将来利用HbAG基因对橡胶树进行遗传改良，可为缩短橡胶树育种年限、提高育种效率提供有效的基因资源。

HbAG gene of rubber tree and application thereof

The present invention provides a rubber tree of HbAG gene, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1. The invention also provides the protein encoded by the HbAG gene and the application of the HbAG gene. The invention first obtains HbAG gene from a rubber tree, belonging to the AG subfamily, and is involved in the development of flowers, the formation of ovule and the maturation of seeds, and performs the functions of D genes. Subcellular localization analysis showed that the gene was localized in the nucleus and was consistent with transcription factors. The gene is transferred into Arabidopsis, transgenic plants, transgenic plants have found that flowering time was significantly ahead of the vegetative growth time is short, and the dwarf phenotype, indicating that the gene in rubber tree growth, flower organs and reproductive development plays an important regulatory role. In the future, genetic modification of Hevea brasiliensis with HbAG gene can provide effective genetic resources for shortening the breeding years and improving the breeding efficiency of Hevea brasiliensis.

【技术实现步骤摘要】
一种橡胶树HbAG基因及其应用
本专利技术生物
，涉及一种橡胶树HbAG基因及其应用。
技术介绍
巴西橡胶树俗称橡胶树，是中国热带地区重要的经济作物，其生产的天然橡胶是关系到国计民生的战略资源。随着国内天然橡胶消费量的逐年增加，受种植条件和宜胶地的限制，提高橡胶树单位面积产量迫在眉睫。橡胶树属多年生乔木，有性世代周期长，在橡胶树新品种选育中存在花多果少，座果率偏低等问题，导致许多杂交组合不能成功组配，使得橡胶树选育种效率受到很大限制，成为橡胶树育种中亟待解决的问题之一。因此，深入研究橡胶树花发育及生殖发育机理，旨在改变橡胶树“繁花少实”的现象，提高其坐果率，可为橡胶树优良杂交组合的配置提供理论基础与技术手段。在植物花器官及生殖发育中，AGAMOUS基因作为一类重要的转录因子基因家族，它们在植物的生长发育和信号转导中起着关键性的调控作用，可以激活或抑制目的基因的转录表达，在植物生长发育和信号转导中起着重要的、不可或缺的作用。如前人研究表明AGAMOUS基因主要参与调控开花时间、决定花器官的发育、影响果实的成熟、调节营养器官的发育、以及对外界信号的响应。
技术实现思路
本专利技术通过对不同发育时期的橡胶树花器官进行转录组测序分析，结合RACE试验和PCR分析，鉴定出一个橡胶树花器官特征因子AGAMOUS(AG)基因，进一步对这个花器官特征因子HbAG基因进行生物信息学分析、进化树分析、时空表达模式分析、亚细胞定位、以及转基因功能验证，显示HbAG的过表达可导致植株矮小，使得营养生长期缩短，从而促进植株提前开花。本专利技术的第一个方面是提供一种橡胶树HbAG基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本专利技术第一个方面所述的橡胶树HbAG基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的第三个方面是提供一种本专利技术第一个方面所述的橡胶树HbAG基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)从橡胶树根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和/或雌花组织中提取总RNA；(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；(3)设计HbAG基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，HbAG基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；(4)PCR产物连接载体，转化，测序，获得HbAG基因基因片段。本专利技术的第四个方面是提供如本专利技术第一个方面所述的橡胶树HbAG基因在促进植株提前开花中的应用。本专利技术的第五个方面是提供如本专利技术第一个方面所述的橡胶树HbAG基因在培育提前开花植株中的应用。本专利技术的第六个方面是提供一种表达载体，其含有本专利技术第一个方面所述的橡胶树HbAG基因。本专利技术的第七个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。该引物对可用于HbAG基因全长序列扩增。本专利技术首次从橡胶树中克隆得到HbAG基因，该基因属于AG亚家族，参与花的发育、胚珠的形成和种子的成熟，执行D类基因功能。通过亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞核，符合转录因子的特征。进一步将该基因转到拟南芥中，获得转基因植株，发现转基因植株出现开花时间明显提前，营养生长时间短，以及植株矮化等表型，表明该基因在橡胶树的花器官发育、以及生殖发育中起着重要的调控作用。将来利用HbAG基因对橡胶树进行遗传改良，可为缩短橡胶树育种年限、提高育种效率提供有效的基因资源。附图说明图1为橡胶树HbAG基因的ORF扩增电泳图。图2为橡胶树MADS-box基因外显子-内含子结构，其中，CDSf片段是第一个外显子，CDSi片段是中间的外显子，CDSl片段是最后一个外显子，刻度尺表示基因的长度，单位bp。图3为橡胶树MADS-box基因的相对荧光定量表达分析结果，其中，Ro代表根、St代表茎、Stt代表茎尖、Le代表叶片、Ba代表树皮、Xy代表木质部、La代表胶乳、Fr代表果实、HX3代表3cm花序、HX6代表6cm花序、HX9代表9cm花序、HX12代表12cm花序、XR代表雄蕊、CR代表雌蕊。图4为植物过表达载体的构建和鉴定结果，其中，A：M:DL5000DNAMarker，1:19T-HbAG质粒经XhoI和PstI双酶切，2:Pxcs-HAStrep质粒经XhoI和PstI双酶切，3:Pxcs-HAStrep质粒无酶切对照；B:M:DL5000DNAMarker，1:Pxcs-HbAG-HAStrep质粒经XhoI和PstI双酶切。图5为转基因拟南芥阳性植株的PCR鉴定结果，其中，A:HbAG基因；B：bar基因；CK：阴性对照。图6为HbAG的转基因植株的表型。具体实施方式下面参照附图，结合具体的实施例对本专利技术作进一步的说明，以更好地理解本专利技术。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.)或酵母遗传法实验指南(MethodsinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual，AdamsAetal编，ColdSpringHarborLaboratory,1998出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。1、橡胶树HbAG基因的克隆(1)取橡胶树的根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和雌花等组织参照InvitrogenReagent提取RNA的方法步骤进行，得到符合后续试验要求的总RNA。反转录，得到cDNA。设计ORF引物，以获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，扩增条件如下：a.设计引物如下：Forwardprimer(5’-3’)：ATGGCATACCAGAGCGAG；Reverseprimer(5’-3’)：TTAAACTAACTGAAGGGACATCTGb.PCR扩增体系如下：c.反应程序为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分，34个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物低温保藏备用。(2)将PCR扩增产物加入5μL6×Loadingbuffer混匀后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，得到的目的条带大小与预期一致。用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收PCR产物，将回收的PCR产物与T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取转化阳性的克隆提取质粒送测序，经过测序确定正确的克隆用于后续克隆及酶切。测序结果与之前的转录组里的序列大部分相同。2、橡胶树HbAG基因生物信息学分析将得到的橡胶树HbAG基因编码序列与橡胶树基因组序列比对，用以筛选相应的基因组序列信息，用FGENESH网站做HbAG基因结构分析(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesh&group＝programs&subgroup＝gfind)，进而得到HbAG基因的内含子与外显子的数目及位置，基因结构分析结果显示橡胶树HbAG基因包含7个外显子，6个内含子(图2)。3、橡胶树不同组织中HbAG基因表达分析选取橡胶树的根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种橡胶树HbAG基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种橡胶树HbAG基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种蛋白质，其特征在于，其为权利要求1所述的橡胶树HbAG基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种权利要求1所述的橡胶树HbAG基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从橡胶树根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和/或雌花组织中提取总RNA；(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；(3)设计HbAG基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：位明明，王亚杰，李维国，黄华孙，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46