人miR-183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种人miR‑183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用，其序列如SEQ ID NO：1所示。由于多种肿瘤细胞中存在miR‑183基因簇的异常表达，且该家族参与细胞增殖、凋亡、迁移相关基因通路的调控，通过设计基因簇敲减元件，可以有效调控基因簇在膀胱癌细胞中的表达，不仅便于科学研究，也有利于控制肿瘤恶性表型和生物学行为。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及一种人miR-183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是内源性非编码RNA，长度为约22个核苷酸。miRNA通常与其靶基因mRNA的3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)结合负向调控其表达。miRNAs可以调控细胞增殖、分化和凋亡。所以，miRNA的发现为肿瘤发病机制的研究提供了新的思路，为肿瘤诊断和治疗提供了新的策略。miR-183基因簇(miR-183家族)是一个高度保守的基因簇，包括定位于7号染色体的miR-183、miR-182和miR-96。研究表明，多种肿瘤细胞中存在miR-183基因簇的异常表达，且该家族参与细胞增殖、凋亡、迁移相关基因通路的调控。因此，开发一种有效调控miR-183/96/182在肿瘤细胞中的表达活性的生物元件，将可以更好地控制肿瘤恶性表型和生物学行为。虽然传统观点认为miRNA可以下调靶基因的表达，但最新研究提示，靶基因也可以反过来抑制miRNA的表达/活性。例如，在果蝇和人类细胞中，拥有与miRNA广泛互补位点的非编码RNA可以有效促发miRNA从3’到5’端的水解反应。这提示，含有与miRNA广泛互补序列的非编码RNA都可能具有特异降解miRNA表达的能力。
技术实现思路
本专利技术提供一种新的人miR-183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用。本专利技术提供一种人miR-183基因簇生物敲减元件，其序列如SEQ ID NO：1所示。一种人miR-183基因簇生物敲减元件的构建方法，所述生物敲减元件的序列如SEQ ID NO：1所示，包括如下步骤：a)体外化学合成经设计的人miR-183、96、182的反义序列各两个拷贝；b)在所述反义序列之间加入连接序列，形成六个拷贝的串联序列；c)在所述串联序列的上下游分别引入酶切位点Xhol和Notl。与各反义序列的第9～12位对应的碱基突变，所述连接序列是CTTC。一种所述的生物敲减元件在治疗膀胱癌药物中的应用。一种所述的生物敲减元件在膀胱癌细胞中调控mir-183基因簇表达的应用。生物敲减元件的调控包括：降低膀胱癌细胞中mir-183基因簇的表达活性、抑制膀胱癌细胞的增殖、促进膀胱癌细胞的凋亡和抑制膀胱癌细胞的迁移。所述膀胱癌细胞是T24和UM-UC-3。一种所述的生物敲减元件在膀胱癌细胞中检测mir-183基因簇表达的应用。检测时，可以将生物敲减元件表达载体转染入膀胱癌细胞T24和UM-UC-3。本专利技术的有益效果是：由于多种肿瘤细胞中存在miR-183基因簇的异常表达，且该家族参与细胞增殖、凋亡、迁移相关基因通路的调控，通过设计基因簇敲减元件，可以有效调控基因簇在膀胱癌细胞中的表达，不仅便于科学研究，也有利于控制肿瘤恶性表型和生物学行为。附图说明图1是本实施方式人miR-183基因簇生物敲减元件的构建示意图；图2是携带miR-183基因簇生物敲减元件的荧光素酶载体对细胞系T24和UM-UC-3内miR-183基因簇的应答图，其中，**表示与对照组相比，p值小于0.01，白色长条指对照组，黑色长条指敲减元件；图3是显示miR-183基因簇生物敲减元件有效抑制膀胱癌细胞增殖的检测结果图，其中，**表示与对照组相比，p值小于0.01；*表示与对照组相比，p值小于0.05，实线指对照组，虚线指敲减元件；图4是显示miR-183基因簇敲减元件有效诱导膀胱癌细胞凋亡的检测结果图；图5是显示miR-183基因簇生物敲减元件对膀胱癌细胞迁移运动能力的抑制的检测结果图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。技术与方法：1.细胞培养膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3购自American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,USA)，细胞培养液由90％的DMEM(Invitrogen,CA)，10％
的胎牛血清(Invitrogen)，1％-2％的谷氨酰胺和0.5％-1％的双抗配成。2.miR-183/96/182基因簇生物敲减元件的构建体外化学合成经设计的人miR-183、96、182的反义序列各两个；并在这些反义序列之间加入连接序列，最终构成六个拷贝的敲减元件。引入酶切位点Xhol和Notl于该元件的上下游，同时用Xhol和Notl酶切psiCHECKTM-2双荧光素酶表达载体。经T4DNA连接酶将二者连接6小时，连接产物转化入感受态细胞，摇菌、涂板、挑选阳性克隆，并提纯质粒。3.细胞转染转染前一天，4-5×104个细胞接种在24孔板上，加入0.5ml培养基，放在37℃、5％CO2培养箱内。生长24小时后，细胞汇合度达到70％，在50ul的无血清培养基内加入1ug重组质粒，柔和混匀。在50ul无血清培养基内加入1ulLipofectamin2000(Invitrogen,CA)试剂，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释好的质粒和Lipo2000轻柔混匀，室温放置20分钟，以便形成质粒/lipofectamin复合物。将质粒/lipofectamin混合物加入24孔板内，轻柔摇晃24孔板。放入培养箱内，4-6小时后更换培养基，48小时后收集细胞，准备下一步实验。4.总RNA提取使用美国nvitrogen公司的Trizol试剂提取总RNA。使用紫外分光光度计和2％琼脂糖凝胶检测提取的总RNA质量。定量后于-80℃储存备用。5.实时定量PCR实时定量PCR检测选用U6(snRNA U6)作为内源对照基因。使用All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit(GeneCopoiea Inc,MD,USA)进行实时逆转录合成cDNA和定量PCR验证。先进行miRNA逆转录合成cDNA。逆转录反应体系为总RNA1μl,2.5U/μl Poly A Polymerase1μl,RTase Mix1μl,5xReaction buffer5μl,dd H2O(RNase-/DNase free)17μl。瞬时离心，37℃孵育60min，然后，85℃酶灭活5min。实时定量PCR总反应体系为20μl,包括10μl2xAll-in-OneTM qPCR Mix,2μl Universal Adaptor PCR Primer(2μM),2μlAll-in-OneTM qPCR Primer(2μM),2μl First-Strand cDNA(diluted in1:5),50xROX Reference Dye0.4μl和3.6μl双蒸水。使用ABI PRISM7000FluorescentQuantitative PCR System(Applied Biosystems,CA,USA)进行qPCR反应和分析。PCR反应均设3个重复。PCR反应参数如下:(1)95℃预变性15min；(2)40个循环,每包括95℃x15s,55℃x20s,70℃x30s。All-in-OneTMmiRNA qPCR
Primer货号为：miR-96,HmiRQP0852；miR-182,HmiRQP0239；miR-183,HmiRQP0244；s本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人miR‑183基因簇生物敲减元件，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种人miR-183基因簇生物敲减元件，其特征在于，其序列如SEQ IDNO：1所示。2.一种人miR-183基因簇生物敲减元件的构建方法，其特征在于，所述生物敲减元件的序列如SEQ ID NO：1所示，包括如下步骤：a)体外化学合成经设计的人miR-183、96、182的反义序列各两个拷贝；b)在所述反义序列之间加入连接序列，形成六个拷贝的串联序列；c)在所述串联序列的上下游分别引入酶切位点Xhol和Notl。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄卫人，刘宇辰，韩永华，蔡志明，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44