细菌无痕遗传操作载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种细菌无痕遗传操作载体，所述载体包括抗毒素开关控制的毒素反筛元件和抗生素抗性基因。还提供了该载体的构建方法及应用该载体进行细菌无痕基因敲除、敲入、替换、点突变及大片段DNA插入和删除(大于194kb)的方法。本发明专利技术利用组成型启动子持续表达毒素蛋白，并利用诱导型启动子诱导表达抗毒素蛋白，建立了抗毒素开关控制的毒素反筛元件(TCCRAS)，解决了现有革兰氏阳性菌的遗传操作系统特异性不高、系统不稳定且筛选困难的问题。

Bacterial traceless genetic manipulation carrier, construction method and application thereof

The present invention provides a bacterial traceless genetic manipulation carrier comprising a toxin switch controlled by a toxin switch, an antibiotic screening element, and an antibiotic resistance gene. Also provides the construction method and application of the carrier carrier bacteria no trace gene knockout and knockin replacement, and the large fragment of DNA point mutation insertion and deletion (greater than 194kb) method. The invention uses constitutively sustained expression of toxin protein promoter, and the inducible promoter induced expression of anti toxin protein, a toxin antitoxin switch control anti screen element (TCCRAS), to solve the specific genetic operating system of the existing gram positive bacteria is not high and the instability of the system and the difficulty of screening.

【技术实现步骤摘要】
细菌无痕遗传操作载体及其构建方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体来说涉及细菌无痕遗传操作载体及其构建方法与应用。
技术介绍
遗传操作系统是指在分子水平上对细胞基因组进行精确修饰(包括基因敲除、敲入、替换和点突变等)的一种生物工程技术，不仅是研究生命基础问题的重要手段，也是人工育种和改良品种的有力工具。目前，多种适用于原核和真核生物的遗传操作方法已经被开发出来，使得研究者能够在多种细胞中进行生理功能和代谢工程研究。现有的遗传操作系统主要包括两大类：一类是基于核酸酶的ZFNs、TALENs以及CRISPER/Cas9等技术；另一类是基于重组酶的Red、Red/ET和Cre/loxP等技术。前一类技术主要应用于真核生物染色体DNA的修饰，其中应用最为广泛的是最近发现的利用原核生物II型适应性免疫系统介导的CRISPER/Cas9技术，能够应用于酿酒酵母、拟南芥、水稻、小麦、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等真核生物中。虽然有文献报道CRISPER/Cas9技术能够应用于一些细菌基因组的修饰，但是该技术的基因编辑效率在不同细菌中有较大差异，如在肺炎链球菌中的基因编辑效率接近100％，而在大肠杆菌中的基因编辑效率则降至60％左右(JiangW.Y.,BikardD.,CoxD.,ZhangF.,MarraffiniL.A.2013.RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems.NatBiotechnol31:233-239)。此外，包括CRISPER/Cas9技术在内的基于核酸酶的基因编辑技术均存在一个共同的致命缺陷，即“脱靶效应”，显著降低了基因编辑的特异性和准确性。因此，基于核酸酶原理的CRISPR/Cas9等技术难以有效地对原核生物进行精确地遗传修饰和改造。在原核生物研究领域中，主要采用的是基于重组酶的遗传操作技术，包括依赖噬菌体重组酶和自身重组酶的遗传操作技术。该类技术需要借助外源DNA的同源序列与染色体的靶序列发生同源重组，从而定向地改变细胞的遗传结构和特性。因此，该类方法均需要构建含有同源序列和筛选标记的外源DNA片段或非复制型质粒。早期的操作方法都是在染色体中引入抗性基因，由于可作为抗性筛选标记的抗生素基因的数目有限，难以进行染色体多个位点的改造，且抗性片段的插入可能会影响细胞的生理功能。随着分子生物学与基因工程的发展，通过引入毒性元件作为反筛标记发展成为细菌有效的无抗性标记或无痕敲除策略。例如利用果聚糖蔗糖酶SacB作为反向筛选标记已经在大肠杆菌(Escherichiacoli)、黄色黏球菌(Myxococcusxanthus)及流感杆菌(Haemophilusinfluenzae)等革兰氏阴性细菌中建立了无痕遗传操作系统(Lalioti,M.D.,Heath,J.K.2001.AnewmethodforgeneratingpointmutationsinbacterialartificialchromosomesbyhomologousrecombinationinEscherichiacoli.NuclAcidsRes29:e14；Wu,S.S.,Kaiser,D.1996.MarkerlessdeletionsofpilgenesinMyxococcusxanthusgeneratedbycounterselectionwiththeBacillussubtilissacBgene.JBacteriol178,5817-5821；Johnston,J.W.2012.AnimprovedcounterselectioncassetteforuseinHaemophilusinfluenzae.Gene492,325-328)。由于革兰氏阳性细菌的细胞壁结构复杂，细胞抗压、抗辐射以及抵抗毒性能力强。因而，目前常用的反向筛选标记无法有效地应用于芽胞杆菌(Bacillus)等大多数的革兰氏阳性细菌中。自20世纪60年代以来，枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)作为革兰氏阳性细菌的模式菌种，其遗传操作系统能够广泛应用于多种革兰氏阳性细菌的代谢机理和信号调控等研究中。虽然已有研究者利用一些新的毒蛋白作为反筛标记建立了无抗性标记的遗传操作方法，如尿嘧啶磷酸核糖转移酶UPP、β-内酰胺酶阻遏蛋白BlaI和鸡蛋清溶菌酶Hewl等。但是这些方法需要构建毒蛋白编码基因缺失的突变株，且靶位点附近留下的重复序列会影响多重突变菌株的稳定性。最近有报道利用诱导表达的毒素蛋白MazF作为反向筛选标记构建了敲除/整合载体pDGREF，能够对枯草芽胞杆菌染色体基因进行点突变和无痕敲除，但该系统的反筛效率较低(25％-65％)、筛选困难(HaojieY.,YanX.,ShenW.,ShenY.,ZhangJ.,LiS.2010.EfficientandpreciseconstructionofmarkerlessmanipulationsintheBacillussubtilisgenome.JMicrobiolBiotechnol20:45-53.)。综合目前研究可知，由于芽胞杆菌等革兰氏阳性细菌的抗毒性能力强，且诱导型启动子难以完全抑制毒素蛋白的渗漏表达，极易使重组菌对毒素蛋白产生抗毒性，从而导致已有的遗传操作技术在芽胞杆菌等革兰氏阳性细菌中的特异性不强、系统不稳定且筛选困难。因此，亟需建立一套新型、高效的革兰氏阳性细菌的无痕遗传操作系统。
技术实现思路
本专利技术提供了一种细菌无痕遗传操作载体及其构建方法与应用，解决了现有革兰氏阳性菌的遗传操作系统特异性不强、系统不稳定且筛选困难的问题。本专利技术的一个方面，提供一种细菌无痕遗传操作载体，所述载体包括抗毒素开关控制的毒素反筛元件TCCRAS(ToxinCounter-selectableCassetteRegulatedbyAntitoxinSwitch)和抗生素抗性基因。以上所述载体，所述抗毒素开关控制的毒素反筛元件包括抗毒素蛋白编码基因、诱导表达抗毒素蛋白编码基因的诱导型启动子、毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子。以上所述载体，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白包括：RelE-RelB、MazF-MazE、ParE-ParD、Doc-Phd、YafQ-DinJ、VapC-VapB、HicA-HicB、CcdB-CcdA、Axe-Txe、YefM-YoeB、RelJ-RelK、HigB-HigA和HipA-HipB；优选为RelE-RelB和MazF-MazE；最优选为RelE-RelB。以上所述载体，所述诱导型启动子为PxylA或Ptac启动子；所述组成型启动子为Pliag或P45启动子。以上所述载体，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白编码基因来源于大肠杆菌Escherichiacoli、嗜热古菌Pyrococcushorikoshii、结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis、詹氏甲烷球菌Methanococcusjannaschii、嗜线虫致病杆菌Xenorhabdusnematophila、肠道沙门氏菌Salmonellaenterica、嗜甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌无痕遗传操作载体，其特征在于，所述载体包括抗毒素开关控制的毒素反筛元件和抗生素抗性基因。

【技术特征摘要】
1.一种细菌无痕遗传操作载体，其特征在于，所述载体包括抗毒素开关控制的毒素反筛元件和抗生素抗性基因。2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述抗毒素开关控制的毒素反筛元件包括抗毒素蛋白编码基因、诱导表达抗毒素蛋白编码基因的诱导型启动子、毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子。3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白包括：RelE-RelB、MazF-MazE、ParE-ParD、Doc-Phd、YafQ-DinJ、VapC-VapB、HicA-HicB、CcdB-CcdA、Axe-Txe、YefM-YoeB、RelJ-RelK、HigB-HigA和HipA-HipB；优选为RelE-RelB和MazF-MazE；最优选为RelE-RelB。4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述诱导型启动子为PxylA或Ptac启动子；所述组成型启动子为Pliag或P45启动子。5.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白编码基因来源于大肠杆菌Escherichiacoli、嗜热古菌Pyrococcushorikoshii、结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis、詹氏甲烷球菌Methanococcusjannaschii、嗜线虫致病杆菌Xenorhabdusnematophila、肠道沙门氏菌Salmonellaenterica、嗜甲烷细菌Methylomicrobiumalcaliphilum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius或弧菌Vibrionigripulchritudo中的一种细菌；优选地，为大肠杆菌Escherichiacoli或肠道沙门氏菌Salmonellaenterica。6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌；优选地，为芽胞杆菌属Bacillus、李斯特氏菌属Listeria、葡萄球菌属Staphylococcus、链球菌属Streptococcus、肠球菌属Enterococcus、梭菌属Clostridium或放线菌Actinomycete中的一种细菌；最优选地，为芽胞杆菌属Bacillus或棒杆菌属Corynebacterium中的一种细菌；所述芽胞杆菌属的细菌为枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus、巨大芽胞杆菌Bacillusmegaterium、解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens、短小芽胞杆菌Bacilluspumilus或地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis中的一种细菌；所述棒杆菌属的细菌为谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum、北京棒杆菌Corynebacteriumpekinense、钝齿棒杆菌Corynebacteriumcrenatum或产氨棒杆菌Corynebacteriumaminogenes中的一种细菌。7.如权利要求1至6中任一所述的载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)扩增毒素蛋白编码基因、抗毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子，按照持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子-毒素蛋白编码基因-抗毒素蛋白编码基因的顺序融合形成重组基因片段；2)将上述步骤1)中获得的重组基因片段与载体连接，获得含有毒素-抗毒素蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：温廷益，邓爱华，吴杰，商秀玲，白桦，张芸，梁勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11