【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及预防呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗及其应用。
技术介绍
1、呼吸道合胞病毒(rsv，respiratory syncytial virus)是全球最常见的导致婴幼儿下呼吸道感染的病原微生物之一。rsv属于副粘病毒科、肺病毒属，其基因组为单股负链病毒，全长15.2kb，编码11个病毒蛋白。根据rsv病毒的基因组序列，将其分为a和b两种亚型。rsv主要有a和b两种亚型，之前的疫苗大多是单亚型的，a和b的f蛋白也有多个氨基酸突变，对于其他毒株，其广谱性会大大降低。此外，mrna疫苗可以将抗原转译到宿主细胞，同时促进不稳定抗原的有效表达，mrna疫苗具有抗原表达效率高、安全性高、免疫原性强、同时激活体液免疫和细胞免疫的优点。
2、呼吸道合胞病毒入侵宿主的第一步是识别宿主细胞的表面抗原，通过病毒的粘附蛋白(attachment，简称g)和融合蛋白(fusion，简称f)共同促进识别并结合宿主受体，然后通过此途径进入细胞。目前rsv疫苗大多以肌注免疫为主，但rsv病毒作为呼吸道病毒，容易引起上呼吸道和下呼吸道感染，所以更改免疫方式，提高机体的黏膜免疫反应将会促进免疫效果。因此我们在做两针mrna疫苗肌注的同时，增加了mrna肌注+蛋白滴鼻的免疫方式。该方式将会大大提高肺部黏膜免疫抗体的分泌，从而保护呼吸道避免病毒侵染。并且通过fi-rsv灭活苗作为对照，评价不同的免疫方式是否会降低rsv疫苗免疫后产生的vde(vaccine-enhanced disease)作用。
3、由于呼吸道合
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术人通过研究在于rsvf蛋白序列进行改造而获得核酸疫苗进而完成本专利技术。
2、本专利技术主要目的是提高疫苗的免疫原性，通过去除了post-f特有的i、iv表位及pre-f、post-f共有的iii表位部分，保留pre-f的表位，提高疫苗诱导抗体的效率；同时利用核酸疫苗的特性，诱导相对于重组蛋白疫苗更强的细胞免疫反应。
3、本专利技术提供一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗，所述核酸疫苗是dna疫苗、mrna疫苗或病毒载体疫苗(优选腺病毒载体疫苗)，所述核酸疫苗对应编码下述蛋白：对rsv a2毒株的f蛋白去除了post-f特有的i、iv表位及pre-f、post-f共有的iii表位部分的rsv f蛋白单体；具体是，去除了post-f特有的i、iv表位及pre-f、post-f共有的iii表位部分的rsv a、rsv b两种亚型毒株的f蛋白单体；
4、或者其以两个或多个蛋白单体串联在一起得到串联蛋白；具体是所述rsv a的f蛋白单体多个(例如，二个、三个、四个、五个、六个)串联得到串联蛋白；具体是所述rsv b的f蛋白单体多个(例如，二个、三个、四个、五个、六个)串联得到串联蛋白；或者所述rsv a的f蛋白单体一个或多个(例如，二个、三个、四个、五个、六个)与所述rsv b的f蛋白单体一个或多个(例如，二个、三个、四个、五个、六个)串联在一起得到的串联蛋白。
5、在具体实施方式中，根据rsv a毒株的f蛋白序列(优选地其如seq id no：1所示氨基酸序列，从n27开始，前m1-q26为信号肽)，去除了n104-v144段(具体是如seq id no：2所示)和v308-s552段(具体是如seq id no：3所示)；将t103与g145之间插入linker序列(例如gs两个氨基酸)链接，将s35突变为t，c37突变为a，e92突变为d，s215突变为p，得到包含pre-f特有的v和表位以及pre-f、post-f共有的ii表位和只含有v40-l45(vskgyl)氨基酸序列的iii表位的rsv a2 f蛋白单体的氨基酸序列如seq id no：4所示；
6、或者，将rsv b9320毒株的f序列(如seq id no：7所示氨基酸序列，从n27开始，前m1-q26为信号肽)同样处理，去除了n104-l142段(如seq id no：8所示)和v308-s552段(如seq id no：9所示)；将c37突变为a，t97突变为m，s197突变为n，q202突变为r，k226突变为m，得到包含pre-f特有的v和表位以及pre-f、post-f共有的ii表位和只含有v40-l45(vskgyl)氨基酸序列的iii表位的rsv b毒株f蛋白单体(具体的，如seq id no：10所示)。
7、更具体地，所述rsv a毒株f蛋白单体的氨基酸序列如seq id no：4所示；所述rsvb毒株f蛋白单体的氨基酸序列如seq id no：10所示。
8、在一个具体实施方式中，所述串联蛋白是将所获得的rsv a毒株f蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起得到；
9、或者所述串联蛋白是将所获得的rsv a毒株f蛋白单体的氨基酸序列和rsv b毒株f蛋白单体的氨基酸序列串联在一起得到；
10、或者所述串联蛋白是将rsv b毒株f蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起得到。
11、在一个极具体的实施方式中，所述串联蛋白的氨基酸序列如seq id no：5、seq idno：11、seq id no：13所示。
12、本专利技术也提供所述的核酸疫苗为有效成分和脂质体组成的核酸疫苗组合物；优选地，通过脂质体包裹所述mrna得到。
13、本专利技术还提供所述的核酸疫苗在制备用于免疫动物获得针对呼吸道合胞病毒抗体的试剂中的应用。
14、本专利技术进一步提供含有编码所述核酸疫苗的dna分子或其重组表达载体在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗中的应用；
15、优选地，所述dna分子的核苷酸序列如seq id no：6、或seq id no：12或seq idno：14所示。
16、在具体实施方式中，所述重组表达载体为哺乳动物细胞表达载体如pcaggs载体；优选地，通过将其导入重组宿主细胞进行表达获得核酸疫苗；更优选地，所述重组宿主细胞哺乳动物细胞如293f细胞。
17、本专利技术还提供含有所述的核酸疫苗的重组宿主细胞在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗中的应用；所述重组宿主细胞哺乳动物细胞如293f细胞。
18、与现有技术例如fi-rsv疫苗相比，本专利技术的优点在于使用多种构建序列，能更好的应对目前不同的rsv病毒，且不产生vde效应，减少炎症发生。同时，在同一疫苗中使用两种不同的pre-f，能够使其免疫原性进行优势互补，更好的产生广谱的免疫反应。此外，我们使用不同的免疫方式比较了两针肌注和一针肌注加一剂滴鼻对小鼠的免疫效果。结果显示含滴鼻的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种呼吸道合胞病毒的核酸疫苗，所述核酸疫苗是DNA疫苗、mRNA疫苗或病毒载体疫苗（优选腺病毒载体疫苗），其特征在于，所述核酸疫苗中对应编码下述蛋白：对RSV A2毒株的F蛋白去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV F蛋白单体；具体是，去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV A、RSV B两种亚型毒株的F蛋白单体；
2.如权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于，
3.如权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于，
4.如权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于，
5.如权利要求4所述的核酸疫苗，其特征在于，所述串联蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13所示。
6.以如权利要求1至5任一项所述的核酸疫苗为有效成分和脂质体组成的核酸疫苗组合物；优选地，通过脂质体包裹所述mRNA得到。
7.如权利要求1至5任一项所述的核酸疫苗在制备用于免疫动物获得针对呼吸道合胞病毒抗体
8.含有编码权利要求1至5中任一项所述的核酸疫苗的DNA分子或其重组表达载体在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗中的应用；
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，重组表达载体为哺乳动物细胞表达载体如pCAGGS载体；优选地，通过将其导入重组宿主细胞进行表达获得核酸疫苗；更优选地，所述重组宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞。
10.含有权利要求1至5任一项所述的核酸疫苗的重组宿主细胞在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗中的应用；所述重组宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种呼吸道合胞病毒的核酸疫苗，所述核酸疫苗是dna疫苗、mrna疫苗或病毒载体疫苗（优选腺病毒载体疫苗），其特征在于，所述核酸疫苗中对应编码下述蛋白：对rsv a2毒株的f蛋白去除了post-f特有的i、iv表位及pre-f、post-f共有的iii表位部分的rsv f蛋白单体；具体是，去除了post-f特有的i、iv表位及pre-f、post-f共有的iii表位部分的rsv a、rsv b两种亚型毒株的f蛋白单体；
2.如权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于，
3.如权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于，
4.如权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于，
5.如权利要求4所述的核酸疫苗，其特征在于，所述串联蛋白的氨基酸序列如seq idno：5、seq id no：11、seq id no：13所示。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：高福，王奇慧，齐建勋，杜沛，马雪慧，李晶，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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