【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种非洲猪瘟蛋白作为纳米颗粒载体的制备方法及应用。
技术介绍
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(asf virus，asfv)感染所引起的严重危害养猪业的高度致死性疾病，对世界经济和食品安全构成了严重的威胁。asf疫情首次于1921年在肯尼亚地区爆发，随后在非洲一些国家和地区流行。近几十年里，asfv已由非洲迅速传播至欧洲和亚洲等地区，并呈现进一步蔓延的趋势。asfv作为一类有囊膜的双链dna病毒，具有复杂且独特的多层膜结构，从内到外依次由核心、核壳、内膜、衣壳和外膜组成。有囊膜的asfv病毒颗粒的直径约为250nm，基因组全长为170-194kb，能够编码150-167种蛋白，分别参与病毒粒子的组装、基因组复制和病毒抵御宿主免疫等过程。由于asfv病毒粒子的结构复杂，基因组巨大，编码蛋白众多，导致目前对其免疫原性蛋白和免疫逃逸机制了解得不是十分清楚。目前仍未成功研发有效的抗asfv疫苗和抗病毒药物，扑杀仍是控制asfv扩散的唯一手段。
2、pa137r蛋白是asfv编码的晚期表达蛋白，定位于病毒工厂，并在病毒感染后期组装到病毒粒子中。研究表明，pa137r与tbk1相互作用，促进自噬介导的溶酶体降解tbk1，从而阻断干扰素调节因子3的核转位，导致i型ifn产生减少，这表明pa137r调节asfv毒力。另一项研究表明敲除a137r基因的asfv-georgia2010(asfv-g)毒株(asfv-g-δa137r)的毒力显著降低。肌肉
3、spycatcher-spytag系统是mark howarth实验室建立的，它是根据酿脓链球菌纤连蛋白结合蛋白fbab的cnab2结构域的内部异肽键开发的。在该结构域中，赖氨酸k31的ε-氨基与天冬氨酸d117的侧链羧基之间自发形成内部异肽键。该反应由空间上相邻的谷氨酸e77催化。由此产生的异肽键赋予了cnab2结构域高度的稳定性。cnab2结构域可稳定地分成两个部分：一个较大的、不完整的138个残基的免疫球蛋白样结构域称为spycatcher(15kda)和一个较短的13个残基的多肽spytag。这两部分能以高亲和力(0.2μm)相互识别，并且形成异肽键，形成共价结合的复合物。spytag-spycatcher系统是一种快速、高效、可靠的肽-蛋白质不可逆连接工具，适用于从提高蛋白质稳定性到疫苗接种过程中的抗原输送等多种应用领域。
技术实现思路
1、本专利技术中，对非洲猪瘟病毒的a137r蛋白进行了表达、纯化和分子量鉴定，并通过冷冻电镜技术，解析了a137r蛋白的结构，发现其呈现中空笼状十二面体的框架结构，能够形成60聚体，直径可达18nm，是一个良好的病毒样颗粒(virus-like particle,vlp)。通过构建、表达并纯化了a137r的1-99位氨基酸，即n端结构域(a137r-n)，并对其分子量进行鉴定，发现a137r仅需要n端1-99个氨基酸就可以完成十二面体60聚体的组装。对笼状结构组成中的关键位点进行了突变，并验证了氨基酸突变对聚体组成形式的影响。由于a137r的高聚形式和十二面体的特征，其可以作为一个纳米颗粒载体进行抗原呈递。将spycatcher添加在a137r蛋白的n端，形成sc-a137r蛋白，发现其形式均一、大小稳定，且其与带有spytag的抗原蛋白能够相互结合，且结合效率高，抗原展示效果优秀，因此具有较好的呈递抗原的能力。
2、因此，本专利技术提供一种作为纳米颗粒载体的融合蛋白，其由非洲猪瘟病毒a137r蛋白和抗原蛋白或spycatcher蛋白融合而成，优选地spycatcher蛋白位于a137r蛋白的n端；更优选地，a137r蛋白和抗原蛋白或spycatcher蛋白之间，任选地由linker序列连接，所述linker连接序列为(ggggs)n，其中，n为1-10之间的任意整数。
3、具体地，非洲猪瘟病毒a137r蛋白是其蛋白全长，或其截短形式，但至少保留第1位至99位氨基酸。
4、本专利技术还提供所述的融合蛋白的编码核酸。
5、本专利技术还提供含有所述的重组表达载体、重组宿主细胞；优选地，所述重组宿主细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；可选地，所述哺乳动物细胞为hek293t细胞、293f系列细胞或cho细胞；进一步可选地，所述293f系列细胞为hek293f细胞、freestyle293f细胞或expi293f细胞；可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、hi5细胞、sf21细胞或s2细胞；可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
6、本专利技术进一步提供所述的融合蛋白作为递呈抗原的纳米颗粒载体中的应用。
7、本专利技术另外提供一种纳米颗粒载体疫苗的制备方法，其由所述的融合蛋白与抗原孵育的步骤。
8、优选地，其是将所述的融合蛋白与抗原于缓冲液中孵育得到，具体地，在室温下孵育1h以上，优选2h以上完成连接。
9、具体地，所述缓冲液是20mm tris，150mm nacl，ph8.0；孵育后还包括去掉多余的抗原的步骤，具体是通过分子筛进行去除；优选地，所述重组抗原是流感病毒、新冠病毒、非洲猪瘟病毒等病原的任意抗原蛋白，具体实施方式中，所述抗原是流感ha、新冠病毒s-rbd抗原；优选地，所述抗原n端还包含信号肽序列；所述抗原的c端还包含spytag及标签序列；可选地，所述标签选自flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签、sumo标签中的至少一种，优选为his标签。
10、本专利技术还提供所述的制备方法得到的纳米颗粒载体疫苗，任选地还包括佐剂。
11、本专利技术提供所述的纳米颗粒载体疫苗在制备用于预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用；可选地，所述病毒选自：流感病毒，冠状病毒，猴痘病毒，等；可选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；进一步优选地，所述片剂为舌下片；进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；进一步优选地，所述粉末剂为散剂；进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
12、本专利技术通过动物实验验证sc-a137r与两种抗原复合物对抗原的递呈效果，使用addavax佐剂制备了亚单位疫苗，表明免疫了纳米颗粒sc-a137r与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种作为纳米颗粒载体的融合蛋白，其由非洲猪瘟病毒A137R蛋白和抗原蛋白或SpyCatcher蛋白融合而成；
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，非洲猪瘟病毒A137R蛋白是其蛋白全长，或其截短形式，但至少保留第1位至99位氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白的编码核酸。
4.含有如权利要求3所述的重组表达载体、重组宿主细胞；优选地，所述重组宿主细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；可选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；进一步可选地，所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞；可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
5.如权利要求1或2所述的融合蛋白作为递呈抗原的纳米颗粒载体中的应用。
6.一种纳米颗粒载体疫苗的制备方法，其特征在于，其由如权利要求1或2所述的融合蛋白与抗原孵育
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其是将如权利要求1或2所述的融合蛋白与抗原于缓冲液中孵育得到，具体地，在室温下孵育1h以上，优选2h以上完成连接。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液是20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0；孵育后还包括去掉多余的抗原的步骤，具体是通过分子筛进行去除；优选地，所述重组抗原是流感病毒、新冠病毒、非洲猪瘟病毒等病原的任意抗原蛋白，例如所述抗原是流感HA、新冠病毒S-RBD抗原；优选地，所述抗原N端还包含信号肽序列；所述抗原的C端还包含标签序列；可选地， 所述标签选自Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、SUMO标签中的至少一种，优选为His标签。
9.如权利要求7至9任一项所述的制备方法得到的纳米颗粒载体疫苗，任选地还包括佐剂。
10.如权利要求9所述的纳米颗粒载体疫苗在制备用于预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用；可选地，所述病毒选自：流感病毒，冠状病毒，猴痘病毒，等；可选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；进一步优选地，所述片剂为舌下片；进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；进一步优选地，所述粉末剂为散剂；进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
...【技术特征摘要】
1.一种作为纳米颗粒载体的融合蛋白，其由非洲猪瘟病毒a137r蛋白和抗原蛋白或spycatcher蛋白融合而成；
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，非洲猪瘟病毒a137r蛋白是其蛋白全长，或其截短形式，但至少保留第1位至99位氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白的编码核酸。
4.含有如权利要求3所述的重组表达载体、重组宿主细胞；优选地，所述重组宿主细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；可选地，所述哺乳动物细胞为hek293t细胞、293f系列细胞或cho细胞；进一步可选地，所述293f系列细胞为hek293f细胞、freestyle293f细胞或expi293f细胞；可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、hi5细胞、sf21细胞或s2细胞；可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
5.如权利要求1或2所述的融合蛋白作为递呈抗原的纳米颗粒载体中的应用。
6.一种纳米颗粒载体疫苗的制备方法，其特征在于，其由如权利要求1或2所述的融合蛋白与抗原孵育的步骤，优选地所述抗原的c端还包含spytag。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其是将如权利要求1或2所述的融合蛋白与抗原于缓冲液中孵育得到，具体地，在室温下孵育1h以上，优选2h以上完成...
【专利技术属性】
技术研发人员：高福，宋豪，施一，彭齐，浩天骄，王敏，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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