【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及靶向药物载体制备领域，具体涉及一种包载双氢青蒿素的pd-1修饰的细胞外囊泡及其制备方法。
技术介绍
1、免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，icis)通过阻断免疫检查点与其配体的结合，解除免疫检查点引起的免疫功能抑制，从而重新激活免疫细胞发挥抗肿瘤作用。目前已有多个icis在抗肿瘤临床应用中取得显著成效，是肿瘤治疗领域的突破性进展。靶向细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic t lymphocyte-associatedantigen-4，ctla-4)、程序性死亡受体1(programmed death-1，pd-1)及程序性死亡受体配体1(programmed death-ligand 1，pd-l1)的抑制剂已成功用于黑色素瘤和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的临床治疗。但是，仅部分患者对治疗有应答，部分应答时间不理想，部分因免疫相关不良反应(iraes)中断治疗等。有研究表明，过表达pd-1的单一细胞膜囊泡可用于肿瘤的免疫治疗。但是这种方法只阻断pd-l1/pd-1信号通路，其治疗效果并不好。因此，我们迫切的需要其他方法与免疫检查点抑制剂进行联合治疗从而扩大癌症患者群体对pd-1/pd-l1阻断的反应。
2、双氢青蒿素(dha)为青蒿素的衍生物，对疟原虫红内期有强大且快速的杀灭作用，能迅速控制临床发作及症状。许多先前的研究已经证明了dha通过诱导氧化应激反应、dna损伤、细胞周期阻滞和程序性细胞死亡、抑制血管生成和肿瘤相关信号转导途径等发挥抗肿瘤作用。
3、细胞外囊泡(extracelluar vesicles,evs)直径100-1000nm，是机体各种细胞在生理、病理条件下包裹细胞内容物分泌至胞外的囊泡状结构体，携带有相关细胞的生物信息，其内包含各种信使分子(rna、dna、代谢物和蛋白质)，能够在细胞间通过内吞融合或配体-受体等方式传递生物活性物质。前期我们团队国际首创肿瘤细胞微颗粒(tmps)作为生物免疫载体包裹化疗药物这一新型个体化/一体化肿瘤靶向生物化疗理论和技术，相关成果发表在science translational medicine(2019，5年if:21.14)和chemicalengineering journal(2022，5年if:14.69)。团队前期的研究表明，tmps作为一种新型靶向生物化疗药物载体包裹化疗药物后具有靶向杀伤肿瘤和抗肿瘤免疫激活效应及其机制。因此，合成包载双氢青蒿素的载药囊泡(evs-dha@pd-1)是提高双氢青蒿素生物利用度、释放其体内有效抗肿瘤作用的有效策略。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种包载双氢青蒿素的pd-1修饰的细胞外囊泡及其制备方法。
2、一种包载双氢青蒿素的pd-1修饰的细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
3、步骤1、将pd-1转染到llc上，得到过表达pd-1的llc细胞；
4、步骤2、将llc细胞培养至90％以上密度后，将上清换为无血清基础培养基，紫外照射细胞30-40分钟，然后将细胞放置于30-40℃的co2培养箱中继续培养24小时以上；
5、步骤3、采用梯度离心法收取肿瘤细胞外囊泡；
6、步骤4、将肿瘤细胞外囊泡与双氢青蒿素按质量比1:4配制电穿孔体系，肿瘤细胞囊泡与双氢青蒿素混合后，用冷pbs定容后，用移液枪吹打混匀后移至电击杯，冰上预冷整个体系；电击一次后，将电击杯放在30-40℃培养箱孵育30分钟以上以恢复囊泡膜完整性，用移液枪将体系溶液完全吸到ep管，采用离心法收集包载双氢青蒿素的pd-1修饰的细胞外囊泡。
7、进一步的，所述步骤1中，pd-1在llc的过表达采用慢病毒载体构建，转染后，选择浓度为5ug/ml嘌呤霉素筛选pd-1过表达的llc并通过l流式分选获得稳定转染的过表达pd-1的llc细胞。
8、进一步的，所述步骤3中的梯度离心方法包括以下步骤：
9、步骤3.1、取细胞上清600xg,10min，弃去细胞沉淀，留下上清2000xg,30min，弃去细胞碎片沉淀；
10、步骤3.2、将获得的上清以16000xg,60min条件，离心后所得沉淀物即为肿瘤细胞外囊泡；
11、步骤3.3、将上一步得到的肿瘤细胞外囊泡经冷pbs清洗2遍后，用100-300ul冷pbs重悬。
12、进一步的，步骤4的肿瘤细胞外囊泡与双氢青蒿素混合前，用冷pbs稀释双氢青蒿素以防体系中过高浓度dmso破坏囊泡的脂质层。
13、包载双氢青蒿素的pd-1修饰的细胞外囊泡，由上述的方法制备得到。
14、本专利技术的有益效果为：
15、本专利技术将pd-1转染到llc上后，得到过表达pd-1的llc细胞，再通过紫外照射的方式得到过表达pd-1的空载囊泡(evs-0@pd-1)，并通过电穿孔后孵育的方法包载双氢青蒿素到肿瘤细胞微颗粒，最后得到包载双氢青蒿素的pd-1修饰的细胞外囊泡(evs-dha@pd-1)，通过纳米粒子示踪技术、投射电镜、western-blot等多维度方法对合成的evs-dha@pd-1进行表征；并且使用高效液相色谱准确定量evs-dha@pd-1中dha的含量，在细胞水平检测evs-dha@pd-1的生物相容性，在动物水平检测evs-dha@pd-1的生物分布，证明所合成evs-dha@pd-1优良的肿瘤靶向性。
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1.一种包载双氢青蒿素的PD-1修饰的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的包载双氢青蒿素的PD-1修饰的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，PD-1在LLC的过表达采用慢病毒载体构建，转染后，选择浓度为5ug/ml嘌呤霉素筛选PD-1过表达的LLC并通过l流式分选获得稳定转染的过表达PD-1的LLC细胞。
3.根据权利要求1所述的包载双氢青蒿素的PD-1修饰的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的梯度离心方法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的包载双氢青蒿素的PD-1修饰的细胞外囊泡及其制备方法，其特征在于，步骤4的肿瘤细胞外囊泡与双氢青蒿素混合前，用冷PBS稀释双氢青蒿素以防体系中过高浓度DMSO破坏囊泡的脂质层。
5.包载双氢青蒿素的PD-1修饰的细胞外囊泡，其特征在于，由权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到。
【技术特征摘要】
1.一种包载双氢青蒿素的pd-1修饰的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的包载双氢青蒿素的pd-1修饰的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，pd-1在llc的过表达采用慢病毒载体构建，转染后，选择浓度为5ug/ml嘌呤霉素筛选pd-1过表达的llc并通过l流式分选获得稳定转染的过表达pd-1的llc细胞。
3.根据权利要求1所述的包载双氢青蒿素...
【专利技术属性】
技术研发人员：金阳，周娥，郭梦菲，李玉梅，李明磊，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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