一种重组腺病毒载体及其构建方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种重组腺病毒载体及其构建方法，其特点是能很好的避免针对Ad5载体本身的预存免疫，即该载体的免疫原性几乎不受人体内广泛存在的Ad5中和抗体干扰。本发明专利技术的实现是基于以人体稀有血清型腺病毒Ad35的抗原决定簇基因替换Ad5的相应部分。而用于替换的稀有血清型腺病毒以及替换基因的选择是基于有利于改造后病毒载体的包装和不影响原病毒载体免疫水平考虑的。

【技术实现步骤摘要】
一种重组腺病毒载体及其构建方法和用途
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒载体及其构建方法。
技术介绍
腺病毒（adenovirus,Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒40（SV40）基因组杂交，说明腺病毒基因组可承载异源性基因。此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统。目前，已经鉴别了57种不同的腺病毒血清型，重组腺病毒载体在基因治疗和疫苗载体方面得到了很多的应用，尤其是人血清5型腺病毒，它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。然而，由于人体内普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性T细胞，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。总之，预存免疫反应会大大降低基于腺病毒载体的疫苗免疫或者基因治疗的效果。为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，研究者们尝试了多种方法：（1）利用新方法运载重组Ad5载体；（2）从其它人体腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体；（3）对Ad5载体进行基因工程改造，这一方法与其他方法相比更安全也更具有应用性。该方法具体是以源于人体安全性较好的人体稀有血清型腺病毒如Ad35、Ad48以及Ad49等的抗原决定簇基因替换Ad5载体的相应基因以期获得既保留Ad5载体的免疫原性，又带有稀有腺病毒亚型血清学性质的嵌合载体。专利CN104419717A公开了一种构建重组腺病毒的方法，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的HVR5、7替换RAd5载体的HVR5、7，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37，但该方法存在如下缺陷：（1）其只是替换HVR，不能完全逃避预存免疫；（2）在制备中使用了至少四个不同公司的载体，价格昂贵，操作不便。因此，目前在该领域仍然需要通过基因工程技术进一步改造腺病毒载体以获得一种操作简便、易于包装、免疫水平较高且能很好的避免预存的重组腺病毒载体。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种重组腺病毒载体及其构建方法，该重组腺病毒载体能很好的避免针对Ad5载体本身的预存免疫，同时既保留Ad5载体的强免疫原性，又带有稀有血清型腺病毒血清学性质，且操作简便。本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：一种重组腺病毒载体，其是采用分子克隆的方法，将Ad5载体的骨架质粒中的整个六邻体（hexon）用人稀有腺病毒血清型Ad35的六邻体替换，得到重组腺病毒载体RAd5-35-Hexon-Adbone。本专利技术还提供一种重组腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：（一）中间载体改造，在Puc19载体的限制性酶切位点XbaI和BamHI间引入AscI和NruI，获得中间载体Puc19-AscI-NruI；（二）将原始Ad5骨架质粒用AscI进行单酶切，回收9620bp的片段，同时用AscI单酶切上述Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，将上述回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-AscI;（三）质粒9620-Puc19-AscI用HindIII单酶切，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切载体Puc19，回收2680bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-HindIII；（四）基于质粒：7000-Puc19-HindIII，在Ad5骨架质粒的Hexon5’端插入酶切位点ClaI，PCR扩增Hexon5’端A和B两段，在片段A和B连接处插入单酶切位点ClaI，引物设计如下：片段A上游：5’-TCTAGACTGGTGACGCAAATAGACGA-3’下游：5’-TCTATCGATGGGGTAGCCATAAGCTT-3’片段B上游：5’-TCTAGACCCATCGATGATGCCGCA-3’下游：5’-CTTGCTCGTCTACTTCGTCTAAGCTT-3’（五）将片段A和B分别连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A和Puc19-B，分别回收3100bp和500bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒Puc19-A+B；（六）用XbaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A+B，回收1000bp的片段，同时用DraIII-HF和RsrII双酶切质粒7000-Puc19-HindIII，回收9800bp的片段，将回收的两部分片段用天根的EsayGeno快速重组克隆试剂盒连接，即构建质粒7000-Puc19-ClaI；（七）PCR扩增Ad35hexon，引物设计如下：上游：5’-ATGGCCACCCCATCGATGCTGCC-3’下游：5’-TACGTGGTAGCGTTGCCGGCCGAGA-3’回收Ad35hexon的2800bp片段；（八）ClaI和NaeI双酶切质粒7000-Puc19-ClaI，回收7000bp的片段，同时ClaI和NaeI双酶切PCR回收的Ad35hexon，回收2800bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒：7000-Puc19-Ad35；（九）HindIII单酶切7000-Puc19-Ad35，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切质粒9620-Puc19-AscI，回收5400bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒：9620-Puc19-Ad35；（十）AscI单酶切原始Ad5骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre，回收25000bp的片段，同时用AscI单酶切质粒9620-Puc19-Ad35，回收9620bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒：RAd5-35-Hexon-Adbone。进一步地，步骤（一）中改造Puc19载体的步骤包括：A.酶切：酶切反应体系为：2μgPuc19载体、1μLXbaI、1μLBamHI、5μLCusmartbuffer以及适量灭菌水，总体积为50μL；反应条件为：37℃，3h，酶切回收2680bp片段。B.制备上下游的反应片段：混合物为：100mmol/L的上游引物、100mmol/L的下游引物以及8μL灭菌水，总体积为10μL，其中上游引物：5’-CTAGATAGGCGCGCCTACCTCGCGAGGAGGCGCGCCTTG-3’；下游引物：5’-GATCCAAGGCGCGCCTCCTCGCGAGGTAGGCGCGCCTAT-3；反应程序为：从95℃梯度降温至4℃，每5min降5℃。C.构建质粒Puc19-AscI-NruI：将回收的2680bp片段和上下游的反应片段连接，连接体系为：10×buffer1μL、T4DNA连接酶1μL、回收的2680bp片段1μL、上下游的反应片段5μL以及灭菌水2μL，总体积为10μL。D.转化、挑取细菌克隆并小提质粒，获得载体Puc19-AscI-NruI。本专利技术还提供该重组腺病毒载体用于制备疫苗或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒载体，其特征在于，其是采用分子克隆的方法，将5型腺病毒(rAd5)载体的骨架质粒中的六邻体用人稀有腺病毒血清型Ad35的六邻体替换，得到重组腺病毒载体rAd5‑35‑Hexon‑Adbone。

【技术特征摘要】
1.一种重组腺病毒载体，其特征在于，其是采用分子克隆的方法，将5型腺病毒(rAd5)载体的骨架质粒中的六邻体用人稀有腺病毒血清型Ad35的六邻体替换，得到重组腺病毒载体rAd5-35-Hexon-Adbone。2.如权利要求1所述的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（一）改造Puc19载体：在Puc19载体的限制性酶切位点XbaI和BamHI间引入AscI和NruI，获得中间载体Puc19-AscI-NruI；（二）将原始Ad5骨架质粒用AscI进行单酶切，回收9620bp的片段，同时用AscI单酶切上述中间载体Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，将上述回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-AscI；（三）质粒9620-Puc19-AscI用HindIII单酶切，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切载体Puc19，回收2680bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-HindIII；（四）基于质粒7000-Puc19-HindIII，在Ad5骨架质粒的六邻体5’端插入酶切位点ClaI，PCR扩增该六邻体5’端A和B两段，在片段A和B连接处插入单酶切位点ClaI，引物设计如下：片段A上游：5’-TCTAGACTGGTGACGCAAATAGACGA-3’下游：5’-TCTATCGATGGGGTAGCCATAAGCTT-3’片段B上游：5’-TCTAGACCCATCGATGATGCCGCA-3’下游：5’-CTTGCTCGTCTACTTCGTCTAAGCTT-3’；（五）将片段A连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A，回收3100bp的...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗升学，王文敬，李婷婷，黎诚耀，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44