本发明专利技术公开了一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，其是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位点XbaI和NotI区域分别引入带SBP标签的CD63和CD9基因，同时在引入的CD63和CD9基因后面添加荧光能力极强的绿色荧光蛋白基因ZsGreen1，构建pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro重组慢病毒载体。本发明专利技术表达外泌体标记物的慢病毒载体具以下优势：成熟速度更快的荧光蛋白基因ZsGreen1具有更强的荧光效果便于即时观察，表达的外泌体携带SBP标签，可实现外泌体观察和纯化一体化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及构建慢病毒表达的外泌体标记质粒及其应用。
技术介绍
外泌体是细胞来源的小泡，存在于生物的体液中和细胞培养的培养基中，其直径在30nm到100nm之间。外泌体又被称为Microvesicles,epididimosomes,argosomes,exosome-likevesicles,microparticles,promininosomes,prostasomes,dexosomes,texosomes,dex,tex,archeosomesandoncosomes。外泌体的形成途径有两个：其一，细胞内的泡体和细胞膜融合形成；其二，直接由细胞膜形成。(维基百科)。外泌体包含各种来源于细胞的成分，诸如蛋白质，RNA，双链DNA，脂肪，代谢分子。但不同的外泌体含有相同的组分。外泌体可通过和其他细胞膜的融合进而内吞来发挥作用，Rabs在细胞内吞途径和外泌体的形成中发挥重要作用。越来越多的研究发现外泌体在生物体正常生理状态下发挥重要作用；也参与各种疾病过程，可用于疾病的诊断，治疗和预后。在正常生理状态下，外泌体介导先天免疫反应和适应性免疫反应；病毒感染中，许多病毒(诸如HIV，HCMV，HSV1，HHV-6，ANDV，SeV，RSV，IAV)可以和外泌体相关蛋白发挥作用，影响Rabs来调节外泌体的形成进而帮助病毒自身复制，传播和修饰免疫。在白血病等癌症中，癌细胞分泌的外泌体通过和其他细胞相互融合，维持癌细胞的微环境，增加细胞的增值能力、运动能力、侵染特性和抗药性；而癌细胞的微环境在癌症的维持和发展中发挥重要作用，癌症来源的外泌体通过以下途径维持肿瘤的微环境：帮助肿瘤细胞逃脱免疫系统和帮助起始免疫反应，促进纤维母细胞和间充质细胞分化为肌成纤维细胞，引起血管形成，促进肿瘤转移。在胃癌的发展过程中外泌体也发挥重要作用1。癌细胞分泌的外泌体可到达体液中，通过检测这些外泌体可帮助癌症的早期诊断。可以通过阻断癌细胞产生外泌体和外泌体-免疫系统，外泌体-其他细胞的相互作用来抑制外泌体介导的肿瘤转移；树突状细胞来源的外泌体可以显著刺激免疫系统的特性，进而攻击肿瘤细胞，抑制肿瘤生长、转移和进展3。由于外泌体是由膜包被的小泡，而且可以和细胞融合，进而可以作为药物载体。通过外泌体来呈递寄生虫的miRNAs给宿主细胞在严重免疫反应的治疗中具有很大潜力。在创伤性脑损伤中，外泌体可以作为实时诊断以及疾病进展的指标。可以通过外泌体来传递核酸形成以外泌体为基础的基因治疗。外泌体在疾病的诊断中十分方便，甚至可以用唾液来作为样品。通过外泌体给药还有一个很大的优势就是可以通过血脑屏障，解决了传统给药方式不容易透过血脑屏障，对于治疗脑部疾病具有重要价值。病毒载体作为传递物质的一种工具，其在科学研究中具有诸多优点，比如：更容易传递DNA进入哺乳动物细胞、容易克隆和修饰。其中的慢病毒载体不仅可以整合进入分裂细胞的基因组，也可以整合入不分裂的细胞的基因组。在科学研究中，为实时观察生物内的状态常常使用一些荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)。荧光蛋白的发现和使用极大促进了科学研究。但这些荧光蛋白由于其亮度较弱而在一定程度上阻碍了研究进展。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供表达外泌体标记物的慢病毒载体：pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro，pCDH-CMV-CD9-SBP--ZsGreen1-EF1-Puro。本专利技术采用如下方案：一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，是以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro为出发载体进行改进，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位点区域分别引入带SBP标签的CD63基因和CD9基因，同时在引入的CD63基因和CD9基因后面添加绿色荧光蛋白基因ZsGreen1。在上述技术方案中，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体为将慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的XbaI和NotI酶切位点之间分别包含CD63-SBP-ZsGreen1和CD9-SBP-ZsGreen片段的慢病毒载体。本专利技术的另一目的是，提供一种上述表达外泌体标记物的慢病毒载体构建方法，按如下的步骤进行：1)根据GeneBank中人CD63、CD9的mRNA上CDS序列、SBP标签序列、ZsGreen1标签蛋白，设计XbaI-CD63-SBP-ZsGreen1-NotI和XbaI-CD9-SBP-ZsGreen1-NotI两个DNA片段，送于上海Invitrogen公司合成双链DNA分子；2)分别用限制性内切酶XbaI和NotI酶切步骤1合成的双链DNA分子，酶切体系：XbaI:1μL，NotI:1μL，缓冲液:3μL，合成的DNA序列:1μg，补充去离子水至30μL、37℃酶切4小时，回收酶切产物；3)用限制性内切酶XbaI和NotI酶切出发载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，酶切体系：XbaI:1μL，NotI:1μL，缓冲液:3μL，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒:1ug，补充去离子水至30μL、37℃酶切4小时，回收载体骨架；4)将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，连接体系：T4DNA连接酶:1μL，缓冲液:1μL，回收的合成DNA序列:20ng，回收的质粒:10ng。16℃连接过夜后，转化大肠杆菌，筛选阳性菌并提取其质粒，得到重组载体pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。上述外泌体标记物慢病毒载体，CD63-SBP-ZsGreen1片段的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；CD9-SBP-ZsGreen1片段的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示；本专利技术同时提供一种上述的外泌体标记物慢病毒载体在生物
中的应用。上述外泌体标记物慢病毒载体在生物
中的应用，利用上述的表达外泌体标记物的慢病毒载体在细胞感染和细胞系构建上的应用。上述外泌体标记物慢病毒载体在生物
中的应用，利用上述的表达外泌体标记物的慢病毒载体在CD63和CD9外泌体SBP亲和纯化上的应用。本专利技术提供的质粒将绿色荧光基因Zsgreen克隆进细胞上，这些表达出来的荧光蛋白就会随着外泌体分泌出来，让载体表达的外泌体CD63、CD9带上绿色荧光，完美实现外泌体实时观察研究活体外泌体的变化，可用于研究外泌体的生物学功能以及其在医学诊断、治疗、预后和给药方式上的参考价值。为构建上述质粒本专利技术在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上将合成的NheI-CD63-SBP-ZsGreen1-NotI、NheI-CD9-SBP-ZsGreen1-NotI插入到多克隆位点MCS处。本专利技术采用的ZsGreen1基因所表达的荧光蛋白，比GFP荧光效果更强，同时设计了SBP位点使用链霉素亲和纯化。因为依据形态学，生物化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，以慢病毒载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro为出发载体进行改进，其特征在于，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体是在pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro的多克隆位点区域分别引入带SBP标签的CD63基因和CD9基因，同时在引入的CD63基因和CD9基因后面添加绿色荧光蛋白基因ZsGreen1。
【技术特征摘要】
1.一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro为出发载体进行改进，其特征在于，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位点区域分别引入带SBP标签的CD63基因和CD9基因，同时在引入的CD63基因和CD9基因后面添加绿色荧光蛋白基因ZsGreen1。
2.如权利要求1所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体，其特征在于：所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体为将慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的XbaI和NotI酶切位点之间分别包含CD63-SBP-ZsGreen1和CD9-SBP-ZsGreen片段的慢病毒载体。
3.一种权利要求2所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体构建方法，其特征在于：按如下的步骤进行：
1)根据GeneBank中人CD63、CD9的mRNA上CDS序列、SBP标签序列、ZsGreen1标签蛋白，设计XbaI-CD63-SBP-ZsGreen1-NotI和XbaI-CD9-SBP-ZsGreen1-NotI两个DNA片段，送于上海Invitrogen公司合成双链DNA分子；
2)分别用限制性内切酶XbaI和NotI酶切步骤1合成的双链DNA分子，酶切体系：XbaI:1μL，NotI:1μL，缓冲液:3μL，合成的DNA序列:1μg，补充去离子水至30μL、37℃酶切4小时，回收酶切产物；
3)用限制性内切酶XbaI...
【专利技术属性】
技术研发人员：金卫林，殷楚，
申请(专利权)人：武汉淼灵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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