本发明专利技术公开了一种PD‑1基因重组病毒。该重组病毒Lenti‑PD‑1‑Puro保藏号为CCTCC No：V201601。本发明专利技术是通过将PD‑1gRNA序列克隆进逆转录病毒质粒Lenti‑CRISPR/Cas9‑Puro中,得到PD‑1重组病毒质粒Lenti‑CRISPR/Cas9‑PD‑1‑Puro，再将此病毒质粒与质粒pSPAX及pMD2.G共同转染293T细胞，完成重组病毒Lenti‑PD‑1‑Puro的包装。此PD‑1重组病毒感染肿瘤患者外周血的T细胞后成功敲除了T细胞上的PD‑1，解除肿瘤患者T细胞的抑制状态，从而使此种PD‑1重组病毒修饰后的T细胞恢复其攻击肿瘤细胞的能力，达到免疫细胞治疗的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术及细胞治疗的技术工程领域，具体涉及一种PD-1基因重组病毒质粒，命名为病毒质粒KGEN-0626，于2016年1月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：V201601，本专利技术还涉及重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro的包装及在利用该重组病毒对肿瘤细胞进行免疫治疗中的应用。
技术介绍
癌症已超过心脏疾病，成为全球第一大死亡原因。癌症治疗在过去几十年中取得了可喜的进展。肿瘤治疗除了外科手术外，还包括化疗、放疗及靶向药物治疗。尽管这些方法在一定程度上控制了癌症的发展，但其缺乏特异性，会在杀死肿瘤细胞的同时杀死正常细胞，此外这些药物治疗毒性大，严重损伤了正常免疫系统，影响病人的生存质量。PD-1(ProgrammedDeath1)程序性死亡受体-1：是一种重要的免疫抑制分子。最初是从小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。PD-1抑制疗法是通过解除肿瘤逃避免疫系统能力的新型免疫治疗方法。癌细胞逃避免疫杀伤的一种机制，是通过它的表面产生一种称为程序性死亡配体-1(PD-L1).当这种PD-L1联接到一类免疫细胞T细胞的PD-1蛋白上即引起T细胞失活。T细胞就不能够发现肿瘤向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。该免疫治疗方法的设计思路是，针对肿瘤患者T细胞上的PD-1基因锁定或基因敲除，将使患者T细胞上的PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1不产生联接，从而激活患者自身的T细胞功能，达到杀死肿瘤细胞的目的。目前美国已经有抗PD-1药物的临床实验，证明了这种机理治疗癌症成效显著。2014年施贵宝公司研制的Opdivo(PD-1抑制剂Nivolumab)先后在日本和美国上市，而默沙东公司研制的Keytruda(PD-1抑制剂Pemboolizamab)则是第一个在美国上市的用于晚期转移皮肤黑色素瘤(Melanoma)的抑制剂，该PD-1抑制剂在这些皮肤黑色素瘤晚期转移病人的临床实验中，被发现持续性地抑制肿瘤，大大提高病人的存活时间和存活率(60％的病人存活超过两年)。更令人振奋的病例发生在纽约斯隆.凯特琳癌症纪念研究中心(MemorialSloanKetteringCancerCenter,MSK)的黑色素瘤病人的治疗反应。一位患有转移性黑色素瘤的49岁女患者，左胸下有一巨大有蒂的坏死性肿瘤。在进行一个剂量的试验性结合免疫治疗3周后，肿瘤消失了。此文发表在4月20号新英格兰杂志(NEJM)上。与此同时，MSK的PaulChapman博士报道，其有效率达22％(74个病人中有16个治疗后未再发现肿瘤存在)。另外，晚期非小细胞性肺癌(NSCLC)和肝癌(HepatocellularCancer)治疗中亦取得相当好的效果。在2015年第5届美国临床肿瘤年会(ASCO)中(5月29日至6月2日在美国芝加哥召开)，美国南加州大学Norris大学癌症中心AnthonyB.EL-Khoueiry教授报导在一项I/II期研究成果表明Nivolamab治疗晚期肝癌是安全有效的。42名患者有8名患者(19％)肿瘤缩小30％，12个月总存活率为62％，最长达17个月，而目前市场上最新药物索拉菲尼(一种FDA批准的晚期肝癌治疗药物-多靶点酪氨酸激酶抑制剂)，客观肿瘤缓解率只有2％的患者有效，总生存率为10-11个月。施贵宝公司亦公布了Opdivo(Nivolumab)的试验数据，在对582位患者临床试验中，使用标准化疗法，四期肺癌患者生存期为9.4个月，而使用Nivolumab药物治疗，患者平均生存期提高到12.2个月，有的甚至到19.4个月。是常规标准化疗的近2倍。另外，默沙东的Keytruda(Pemboolizumab)是美国首个获批的抗PD-1药物，用于恶性黑色素瘤及非小细胞性肺癌。另外在临床试验中，对胃癌(GastricCancer)的有效率达53％的患者肿瘤缩小。食管癌(EsophagealCancer)患者52％肿瘤缩小，头颈部肿瘤(HeadandNeckCancer)57％的肿瘤缩小。综上所述，PD-1抗体药物治疗肿瘤疗效显著。然而目前国内尚无PD-1抗体，PD-1抗体治疗药物仍在研发之中，尚未进入临床试验。另外，PD-1抗体制备及纯化过程复杂，周期长，制造成本高，造成抗体药物昂贵，事实上普通百姓是难于承受这种高昂的治疗费用。有鉴于此，我们专利技术了一个PD-1重组病毒的制备方法，并利用此重组病毒进行肿瘤的免疫细胞治疗。
技术实现思路
本专利技术通过构建PD-1重组病毒质粒，并通过包装得到重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro，同时利用此重组病毒经体外感染T细胞从而敲除T细胞上PD-1受体，从而使此种基因修饰后的T细胞恢复在人体内攻击肿瘤细胞的能力，达到免疫细胞治疗的作用。本专利技术提供了一种PD-1基因重组病毒质粒，属逆转录病毒质粒，命名为病毒质粒KGEN-0626，于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：V201601，其序列为SEQIDNO：1。本专利技术还提供了上述所述PD-1基因重组病毒质粒的构建，其是通过选择PD-1基因序列中2859-2878共20个碱基序列即CACGAAGCTCTCCGATGTGT作为PD-1特异性引导RNA即gRNA，并在T4连接酶的作用下与其互补链ACACATCGGAGAGCTTCGTG结合形成双链互补DNA，最后将此双链DNA克隆进病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-Puro即得到重组PD-1病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。上述所述PD-1基因重组病毒质粒的构建，其具体包括下述步骤：1)使用EcoR1和Age1核酸内切酶和磷酸酶37℃处理30分钟去磷酸化Lenti-CRISPR/Cas9质粒；2)以PD-1基因序列中2859-2878位的共20个碱基序列作为PD-1特异性引导RNA也即PD-1gRNA，在T4连接酶的作用下将PD-1gRNA引物序列与其互补的链经37℃孵育30分钟，95℃孵育5分钟，再以每分钟5℃的速度降温至25℃的条件退火合成PD-1双链DNA；3)使用快速核酸连接酶将PD-1双链DNA与Lenti-CRISPR/Cas9-Puro质粒连接，室温孵育10分钟即可得到重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。本专利技术还提供了一种重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro，其包含有PD-1基因重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。上述所述重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro的包装，包括下述步骤：1)将重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro转入Stbl3细菌，经氨苄青霉素筛选，扩增，纯化，测序；2)转染前一天种293T细胞到10cm培养皿，细胞密度以第二天长到细胞80％汇合为宜；培养基为DMEM，其中含10％胎牛血清、5000U的抗生素；抗生素可以为氨苄青霉素和/或链霉素本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种PD‑1基因重组病毒质粒，属逆转录病毒质粒，命名为慢病毒载体KGEN‑0626，于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201601，其序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种PD-1基因重组病毒质粒，属逆转录病毒质粒，命名为慢病毒载体KGEN-0626，
于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：V201601，
其序列为SEQIDNO：1。
2.权利要求1所述PD-1基因重组病毒质粒的构建，其是通过选择PD-1基因序列中
2859-2878共20个碱基序列即CACGAAGCTCTCCGATGTGT作为PD-1特异性引
导RNA即gRNA，并在T4连接酶的作用下与其互补链
ACACATCGGAGAGCTTCGTG结合形成双链互补DNA，最后将此双链DNA克隆
进病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-Puro即得到重组PD-1病毒质粒
Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。
3.权利要求1或2所述PD-1基因重组病毒质粒的构建，其特征在于，包括下述步
骤：
1)使用EcoR1和Age1核酸内切酶和磷酸酶37℃处理30分钟去磷酸化
Lenti-CRISPR/Cas9质粒；
2)以PD-1基因序列中2859-2878位的共20个碱基序列作为PD-1特异性引导RNA
也即PD-1gRNA，在T4连接酶的作用下将PD-1gRNA引物序列与其互补的链经
37℃孵育30分钟，95℃孵育5分钟，再以每分钟5℃的速度降温至25℃的条件退
火合成PD-1双链DNA；
3)使用快速核酸连接酶将PD-1双链DNA与Lenti-CRI...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙昌秀，
申请(专利权)人：安徽柯顿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。