在质粒序列转录过程中防止畸变RNA形成的方法和组合物技术

包括单链ＤＮＡ或ＲＮＡ、部分双链ＤＮＡ和双链ＤＮＡ的多核苷酸分子，含有终止子序列和／或其他修饰序列，所述终止子序列和／或其他修饰序列可以在转染宿主细胞时抑制从这些分子产生的多余多核苷酸的种类。这些分子可以用于增强转染宿主细胞中选定多核苷酸序列转录效率的方法，并降低产生多余转录产物的潜力。而且，本发明专利技术方法还可用于避免在宿主细胞或宿主中存在的某些多核苷酸表达的消失或下调。这些组合物和方法在治疗、疫苗、诊断和研究领域具有用途。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过降低多余多核苷酸序列表达，增强宿主细胞中多核苷酸序列表达效率的方法和多核苷酸组合物。更确切地说，本专利技术涉及通过应用这些组合物防止畸变DNA和RNA序列表达的新的组合物和方法。
技术介绍
业已有文献指出，多核苷酸组合物可以用于医药，主要治疗或预防哺乳动物的疾病，以及用于这些领域的研究。确切地说，现在大量活动都围绕在应用多核苷酸组合物治疗细胞外和细胞内病原性感染，如病毒、细菌、真菌感染等。例如，有文献指出，DNA疫苗可以给哺乳动物细胞体内传递一种物质，该物质可以利用哺乳动物免疫系统对抗病原体。因此，这样的疫苗被设计成表达，例如表达蛋白或多肽，在接触感染物质刺激时，可以引起体液或细胞免疫应答。另一方面，基因治疗的载体也是多核苷酸组合物，通常设计用来给哺乳动物细胞传递一种蛋白质，所述蛋白质在哺乳动物中或者不表达、或者不正常表达、或者低表达。这些载体通常必然引起针对这些多核苷酸序列的种特异性免疫应答反应，所述多核苷酸序列被识别为抗原，并可引起多余细胞免疫应答。多核苷酸组合物的其他治疗应用是将缺失的或低表达的蛋白质导入患病哺乳动物患者。而且，多核苷酸本身可以作为有用的体内反应物，用于诊断/成像方法，作为反应物用于基因治疗、反义方法、疫苗应用，或者作为药物用于治疗或预防多种疾病，如遗传缺陷、感染性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病。多核苷酸还可作为体外反应物用于各种试验，如生物研究试验，医学、诊断、筛查和污染检测试验。一系列本领域熟知的问题阻止了多种多核苷酸组合物成为广为接受的有用医药品。因此，至今被医药界接受用于治疗哺乳动物疾病的这种DNA疫苗或治疗剂还很少。被称为转录后基因静默和转录静默的现象，业已在植物、线虫和果蝇中观察到。该现象提示，表达与调控元件具有某些同源性的多核苷酸序列的病毒、类病毒、质粒或RNA转染或感染植物、线虫或果蝇，可以导致内源性调控元件和/或基因以及外源性序列表达的永久抑制，所述调控元件如已在细胞中表达的启动子或自身基因或其一部分。这一静默效应业已显示是基因特异性的。见，例如，L.Timmons and A.Fire，Nature，395354(Oct.29，1998)；A.Fire et al.，Nature，391806-810(Feb.19，1998)；R.Jorgensen et al.，Science，2791486-1487(March 6，1998)；J.R.Kennerdell and r.W.Carthew，Cell，951017-1026(Dec.1998)；L.Misquitta and B.M.Paterson，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，961451-1456(Feb.1999)；M.K.Montgomery et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9515501-15507(Dec.1998)]。编码全长前α1胶原基因的DNA质粒瞬时转染啮齿类动物成纤维组织细胞系后，观察到天然胶原基因的“静默”效应，以及基因的瞬时表达。。多核苷酸分子应用的另一个问题是形成畸变的RNA或DNA，而不是形成所需的包括基因的转录产物。业已假定，畸变RNA或DNA的形成发生在应用任何转染质粒或多核苷酸酸分子的情况下，降低靶基因表达的效率。畸变或异常RNA可能是上述静默效应的一个原因。本领域众所周知，有很多可以通过商业渠道购买的序列具有终止转录的功能。例如，RNA聚合酶II的休止位点与转录终止有关，特别是当该位点位于瞬时表达系统中强poly A信号的直接下游时。。但是，直至今天，还没有建议，利用终止机制来创建一种有效的功能性组合物或方法，用于增加在医药、疫苗、基因治疗和诊断领域多核苷酸表达的效率。本领域确实存在这样一种需求，即应用相同的机制，利用多核苷酸组合物和方法，抑制畸变RNA或DNA分子的形成，增加宿主细胞中选定多核苷酸序列的表达。专利技术简述本专利技术的一个方面，提供了一种双链多核苷酸(优选脱氧核酸核酸)分子，该分子包括第一条编码链和第二条转录模板链。第一条链包括(i)至少一个表达盒序列，该序列包括，从5’端到3’端，一个启动子，一个由启动子控制表达的选定多核苷酸序列和一个poly A位点，以及(ii)至少一个第一条链的终止序列。选定表达盒多核苷酸序列可以是任何需要在细胞中表达行使某种生物功能的多核苷酸序列。第一条终止子序列优选位于启动子的5’端，位于poly A位点的3’端，位于第一条链表达盒序列的外部，或位于表达盒序列选定多核苷酸序列中。第一条链的终止序列位于既不阻止第二条链序列转录的位置，也不影响被表达多核苷酸序列功能的位置，所述第二条序列与表达盒序列互补。第二条链与第一条链互补。第二条序列中与第一条链终止子序列互补的部分，不阻止与第一条链表达盒互补的第二条链序列的转录。而且，第二条链包括至少一个第二条链终止子序列，该序列可以终止始于第二条链的转录。第二条链终止子序列优选位于第二条链与第一条链表达盒互补序列之外，并且位于既不阻止与表达盒序列互补序列转录的位置，并且当多核苷酸序列表达时，也不削弱其生物功能的位置。本专利技术的另一方面，提供了一种药物组合物，该组合物包括上面鉴定的双链多核苷酸分子，可选的促进细胞摄入多核苷酸(如DNA)的试剂，以及适宜的药用载体。这些组合物可用于治疗细胞内病原性感染，如病毒。其他的这些组合物可以用于治疗某些肿瘤。其他的这些组合物可用于治疗某些细胞外病原体。本专利技术的另一方面，提供了单链多核苷酸序列，该序列选自上述双链多核苷酸分子的第一条链或第二条链。本专利技术的另一方面，提供了一种药物组合物，该组合物包括上面鉴定的单链多核苷酸分子，可选的促进细胞摄入多核苷酸(如DNA)的试剂，以及适宜的药用载体。本专利技术的另一方面，提供了一种方法，该方法提高宿主细胞中选定多核苷酸序列的表达效率，该方法包括以下步骤应用上述双链DNA分子或其单链转染宿主细胞，从而抑制宿主细胞中从多核苷酸分子转录的畸变多核苷酸序列的形成。本专利技术的另一方面，提供了一种单链RNA分子，所述单链RNA分子包括一个具有5’端和3’端的核糖核酸序列，经由修饰防止双链或部分双链区的形成。在一个实施方案中，这个分子含有一个5’端帽。在另一个实施方案中，这个分子没有帽。在另一个实施方案中，这个分子具有3’端poly A尾。在另一个实施方案中，这个分子没有poly A尾。本专利技术的另一方面，提供了一种药物组合物，该组合物包括上面鉴定的单链RNA分子，可选的促进细胞摄入RNA的试剂，以及适宜的药用载体。本专利技术的另一方面，提供了一种方法，该方法提高宿主细胞中选定多核苷酸序列的表达效率，该方法包括以下步骤应用上述单链RNA分子转染宿主细胞，从而抑制宿主细胞中畸变RNA分子的形成。本专利技术的另一方面，提供了治疗哺乳动物的一种方法，该方法包括给予有效剂量的药物组合物，所述组合物包括上述任意多核苷酸分子，可选的促进细胞摄入DNA或RNA的试剂，以及适宜的药用载体。本专利技术的另一方面，提供了一种方法，该方法防止宿主细胞中多核苷酸序列的无意关闭或下调，所述宿主细胞转染了含有选定多核苷酸序列的多核苷酸分子，所述选定多核苷酸序列与该宿主细胞中存在的多核苷酸序列同源。该方法包括以下步本文档来自技高网...

【技术保护点】
双链多核苷酸分子，包括第一条编码链和第二条转录模板链：（ａ） 所述第一条编码链包括（ｉ）一个表达盒序列，从５’端到３’端，包括启动子、由所述启动子控制其表达的选定多核苷酸序列和ｐｏｌｙ Ａ位点，以及（ｉｉ）至少一个第一条链终止子 序列；以及（ｂ） 所述第二条链与第一条链互补，其中，所述第二条链与第一条链终止子序列互补的部分不阻止第二条链上与第一条链表达盒互补序列的转录，并且，其中所述第二条链包括至少一个第二条链终止子序列，该序列终止始于所述第二条链上与所述第一条 链表达盒互补的第二条链序列之外的转录。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：C萨燕斯钱德兰，CJ帕楚克，
申请(专利权)人：惠氏公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]