修饰化人源粒细胞-集落刺激因子及其制备方法技术

培养用包含一个编码修饰化ｈＧ－ＣＳＦ基因的表达载体转化的微生物，生产修饰化人源粒细胞一集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ），并将修饰化ｈＧ－ＣＳＦ分泌到周质，上述修饰化ｈＧ－ＣＳＦ是通过用其它的氨基酸代替野生型ｈＧ－ＣＳＦ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）的第１个，第２个，第３个和第１７个中至少一个氨基酸获得的。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
修饰化人源粒细胞－集落刺激因子及其制备方法 专利
本专利技术涉及修饰化人源粒细胞—集落刺激因子(hG-CSF)，编码上述多肽的基因，包含上述基因的载体，使用上述载体转化的微生物以及使用上述微生物生产该修饰化hG-CSF的方法。专利技术背景术语集落刺激因子(CSF)包括粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，它们是由T细胞，巨噬细胞，成纤维细胞与内皮细胞产生的。GM-CSF刺激粒细胞或巨噬细胞的干细胞以诱导粒细胞或巨噬细胞克隆的分化与增殖。M-CSF和G-CSF主要是分别诱导巨噬细胞与粒细胞克隆的形成。在体内，G-CSF诱导骨髓白细胞的分化并增强成熟粒细胞的功能，因此，它在治疗白血病方面的医学重要性已经被充分证实。人源G-CSF(hG-CSF)是一个包含174或177个氨基酸的蛋白质，其中174个氨基酸的种类具有更高的嗜中性粒细胞-增强活性(Morishita，K.et al.，J.Biol.Chem.，262，15208-15213(1987))。包含174个氨基酸的hG-CSF的氨基酸序列如图1所示。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰化人源粒细胞－集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ），特征在于野生型ｈＧ－ＣＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）的第１个，第２个，第３个和第１７个氨基酸中至少一个被其它氨基酸替代。

【技术特征摘要】
KR 1999-7-8 1999/27418范围所限定的本发明主旨的情况下，可以进行多种改变和修饰。序列表<110> Pharm.Co.，Ltd.<120> 修饰化人源粒细胞——集落刺激因子及其制备方法<130> PCA00729/HMY<160> 71<170> KOPATIN 1.0<210> 1<211> 522<212> DNA<213> 人<220><221> CDS<222> (1)..(522)<400> 1aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15tgc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30gag aag ctg tgt gcc acc tac aag ctg tgc cac ccc gag gag ctg gtg 144Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45ctg ctc gga cac tct ctg ggc atc ccc tgg gct ccc ctg agc tcc tgc 192Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60ccc agc cag gcc ctg cag ctg gca ggc tgc ttg agc caa ctc cat agc 240Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80ggc ctt ttc ctc tac cag ggg ctc ctg cag gcc ctg gaa ggg ata tcc 288Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95ccc gag ttg ggt ccc acc ttg gac aca ctg cag ctg gac gtc gcc gac 336Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110ttt gcc acc acc atc tgg cag cag atg gaa gaa ctg gga atg gcc cct 384Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125gcc ctg cag ccc acc cag ggt gcc atg ccg gcc ttc gcc tct gct ttc 432Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe130 135 140cag cgc cgg gca gga ggg gtc ctg gtt gct agc cat ctg cag agc ttc 480Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160ctg gag gtg tcg tac cgc gtt cta cgc cac ctt gcg cag ccc 522Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170<210> 2<211> 174<212> PRT<213> 人<400> 2Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170<210> 3<211> 32<212> DNA<213> 人工序列<220><223> hG-CSF N末端的寡核苷酸引物<400> 3cgccgccata tgacacccct gggccctgcc ag 32<210> 4<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220><223> hG-CSF C末端的寡核苷酸引物<400> 4accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcg 36<210> 5<211> 72<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 制备大肠杆菌肠毒素II信号肽的寡核苷酸<400> 5tcatgaaaaa gaatatcgca tttcttcttg catctatgtt cgttttttct attgctacaa 60atgcctacgc gt 72<210> 6<211> 72<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 制备大肠杆菌肠毒素II信号肽的寡核苷酸<400> 6acgcgtaggc atttgtagca atagaaaaaa cgaacataga tgcaagaaga aatgcgatat 60tctttttcat ga 72<210> 7<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 编码[Ser1]hG-CSF N端的寡核苷酸引物<400> 7acaaatgcct acgcgtctcc cctgggccct gccagctcc 39<210> 8<211> 42<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 编码[Ser1]hG-CSF C端的寡核苷酸引物<400> 8accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcgtaga ac 42<210> 9<211> 65<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 编码大肠杆菌肠毒素II Shine-Dalgarno序列的寡核苷酸引物<400> 9cggtttccct ctagaggttg aggtgtttta tgaaaaagaa tatcgcattt cttcttgcat 60ctatg 65<210> 10<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 包含BamHI限制性内切酶位点的寡核苷酸<400> 10accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcgtaga acgcg 45<210> 11<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 大肠杆菌肠毒素II信号肽的最后5个氨基酸加hG-CSF的第1到第5个氨基酸<400> 11Thr Asn Ala Tyr Ala Thr Pro Leu Gly Pro1 5 10<210> 12<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 制备[Thr1]hG-CSF的寡核苷酸<400> 12acaaatgcct acgcgacacc cctgggccct 30<210> 13<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO12的反意链<400> 13agggcccagg ggtgtcgcgt aggcatttgt 30<210> 14<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 以苏氨酸作为第4个氨基酸的大肠杆菌肠毒素II信号肽的N末端序列<400> 14Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu1 5<210> 15<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用苏氨酸替换大肠杆菌肠毒素II信号肽的第4个氨基酸的寡核苷酸<400> 15ggtgttttat gaaaaagaca atcgcatttc ttc 33<210> 16<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID No15的反意链<400> 16gaagaaatgc gattgtcttt ttcataaaac acc 33<210> 17<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 以谷氨酸作为第22个氨基酸的大肠杆菌肠毒素II信号肽的C末端序列<400> 17Asn Ala Gln Ala Thr Pro Leu Gly1 5<210> 18<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用谷氨酸替换大肠杆菌肠毒素II信号肽的第22个氨基酸的寡核苷酸<400> 18caaatgccca agcgacaccc ctgggc 26<210> 19<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO18的反意链<400> 19gcccaggggt gtcgcttggg catttg 26<210> 20<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 修饰化大肠杆菌肠毒素II Shine-Dalgarno序列的寡核苷酸<400> 20tctagaggtt gaggtgtttt atga 24<210> 21<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO20的反意链<400> 21tcataaaaca cctcaacctc taga 24<210> 22<211> 66<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 含有大肠杆菌偏爱的编码[Ser17]hG-CSF第6到第26个氨基酸的S1寡核苷酸序列<400> 22cagcctcttc tcttccacaa tctttccttc ttaagtctct tgaacaagtt agaaagatcc 60aaggcg 66<210> 23<211> 66<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO22的反意链(AS1寡核苷酸)<400> 23ccgggtcgga gaagagaagg tgttagaaag gaagaattca gagaacttgt tcaatctttc 60taggtt 66<210> 24<211> 21<212> PRT<213> 大肠杆菌<220><221> 信号<222> (1)..(21)<223> 大肠杆菌OmpA信号肽<400> 24Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile A la Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala20<210> 25<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 含有Hind III识别位点的寡核苷酸<400> 25gttgcgcaag cttctcga 18<210> 26<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO25的反意链<400> 26tcgagaagct tgcgcaac 18<210> 27<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220><223> [Ser1]hG-CSF N末端的寡核苷酸<400> 27gttgcgcaag cttctcccct gggccctgcc agctccctg 39<210> 28<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 含有EcoRI限制性酶切位点的寡核苷酸<400> 28accgaattct cagggctgcg caaggtggcg tagaacgcg 39<210> 29<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 大肠杆菌OmpA信号肽加[Ser1]hG-CSF的第1到第5个氨基酸<400> 29Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ser Pro Leu Gly Pro1 5 10<210> 30<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 制备[Thr1]hG-CSF的寡核苷酸<400> 30accgttgcgc aagctacacc cctgggccct 30<210> 31<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO30的反意链<400> 31agggcccagg ggtgtagctt gcgcaacggt 30<210> 32<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 制备[Ser17]hG-CSF的寡核苷酸<400> 32agcttcctgc tcaagtcttt agagcaagtg agg 33<210> 33<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO32的反意链<400> 33cctcacttgc tctaaagact tgagcaggaa gct 33<210> 34<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 制备[Thr17]hG-CSF的寡核苷酸<400> 34agcttcctgc tcaagacctt agagcaagtg agg 33<210> 35<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO34的反意链<400> 35cctcacttgc tctaaggtct tgagcaggaa gct 33<210> 36<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 制备[Ala17]hG-CSF的寡核苷酸<400> 36agcttcctgc tcaaggcctt agagcaagtg agg 33<210> 37<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO36的反意链<400> 37cctcacttgc tctaaggcct tgagcaggaa gct 33<210> 38<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 制备[Gly17]hG-CSF的寡核苷酸<400> 38agcttcctgc tcaagggctt agagcaagtg agg 33<210> 39<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SEQ ID NO38的反意链<400> 39cctcacttgc tctaagccct tgagcaggaa gct 33<210> 40<211> 33<212> DNA<213> ...

【专利技术属性】
技术研发人员：权世昌，郑圣烨，裴城敏，李宽淳，
申请(专利权)人：韩美药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]