制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法，步骤如下：1）选用工程菌大肠杆菌JM109做菌株进行种子液培养；2）收集种子液培养、发酵和菌体；3）粗纯；4）精纯；5）原液的保存；本发明专利技术采用了离子交换层析、疏水层析、超滤脱盐、离子交换层析II、分子筛层析法，获得重组人粒细胞刺激因子原液，提高了纯化效率和纯化质量，经检测，所得的原液按中国药典和欧洲药典检测，纯度分别达到95％和98%以上，比活性分别达到了6×107U/mg和1.0×108U/mg以上，分别达到国家标准和欧洲检验标准。

Method for preparing Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor solution

The present invention relates to the field of biotechnology, in particular relates to a method for preparing Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor solution, purification steps are as follows: 1) the E.coli JM109 strain seed liquid culture; 2) seeds were collected in liquid culture, fermentation and bacteria; 3) coarse pure pure; 4); 5) solution preservation; the invention adopts the ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, ultrafiltration, ion chromatography, molecular sieve chromatography II exchange, Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor solution, improve the quality and efficiency of purification purification, after testing, the solution according to the China Pharmacopoeia and European Pharmacopoeia detection, the purity reached more than 95% and 98%, specific activity reached 6 * 107U/mg and 1 * 108U/mg, reach the national standard and European standard respectively.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法。
技术介绍
重组人粒细胞刺激因子,惠尔血,赛格力,赛强,吉粒芬（Filgrastim, Recombinant Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor, rhG-CSF）是特异作用于粒系祖细胞、促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化的造血生长因子；其主要作用如下：(1)促进骨髓移植后中性粒细胞的恢复；(2)治疗肿瘤化疗后中性粒细胞减少症；(3)治疗伴随骨髓异常增生综合征之中性粒细胞减少症；(4)治疗伴随再生不良性贫血之中性粒细胞减少；(5)治疗先天性、特发性中性粒细胞减少症。专利号 CN1030141000 B一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，该方法包括以下步骤：a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产 物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子；采用此专利的反相填料精细分离，rhG-CSF 电泳纯度由 90％提高到99％，HPLC 纯度由90％提高到99％，其比活由0.8×107U/mg 提高到3×108U/mg；可见，采用本专利技术的重组人粒细胞集落刺激因子的纯化工艺，可以大幅度的提高 rhG-CSF 的纯度、比活，以及稳定性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法，其纯化的产品既能符合国家标准又能符合欧洲检验标准，该方法具体包括：制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法，该方法包括以下步骤：1）选用工程菌大肠杆菌JM109做菌株进行种子液培养，该菌种来源于A.T.C.C；2）收集种子液培养、发酵和菌体；3）粗纯：对包涵体收集、洗涤、变性、复性、离子交换上样液制备；4）精纯：经离子交换层析、疏水层析、超滤脱盐、离子交换层析Ⅱ、分子筛层析，获得重组人粒细胞刺激因子原液；5）原液的保存。所述步骤 2) 收集种子液培养、发酵和菌体，具体实施步骤为：A）将冻存的种子液解冻，接种100μl于50ml LB培养基后，37℃±1℃进行一级种子培养；B）按1%接种量，将一级种子液接种于LB培养基后，37℃±1℃进行二级种子培养，将二级种子液按1:10接种量接种于发酵罐，进行发酵；C）控制发酵温度为37℃±1℃、pH6.8±0.2；每小时取样测OD6000.5，随菌体生长情况对转速、空气流量实施调节，进入对数生长期后，开始补加培养基，视OD值情况加入IPTG，继续培养至OD6000.5不再明显升高为止；收集发酵液，离心收集沉淀得菌体；发酵过程中表达产生重组人粒细胞刺激因子蛋白以包涵体形式存在于菌体内。所述步骤 3) 粗纯：对包涵体收集、洗涤、变性、复性、离子交换上样液制备，具体实施步骤为：A）包涵体收集、洗涤粗包涵体获得洗涤：将湿菌体和10-100mmol/L Tris-HCl 溶液按1:10的比例充分搅匀，离心收集沉淀；再次按1:10的比例在收集的沉淀中加入10-100mmol/L Tris-HCl 溶液后充分搅匀，将得到的悬液进行破菌，破碎率达到95%，离心收集沉淀，得到粗包涵体；洗涤后包涵体获得：将得到的粗包涵体和10-20mmol/L Tris-HCl、2-4mol/L脲、1-5mmol/L EDTA的缓冲溶液按1:15的比例充分搅匀,离心，收集沉淀；按1:15的比例往上步得到的沉淀中加入10-60mmol/L Tris-HCl溶液后充分搅匀，离心收集沉淀，如此两次得洗涤后包涵体；B）包涵体变性和复性搅拌状态下，将包涵体重悬液加入10-100mmol/L Tris-HCl、5-9mol/L 脲、 1-5mmol/L EDTA（pH8.5）缓冲液中，往上述已加入包涵体的缓冲溶液内加入β-巯基乙醇，封口，继续搅拌，得到包涵体裂解液；将以上包涵体裂解液离心收集上清至无菌去热原容器中，搅拌状态下往其中缓慢加入6-10倍体积的10-100mmol/L Tris-HCl 缓冲液；对增溶完成得到的溶液用10-100mmol/L Tris-HCl 缓冲液超滤，并搅拌增氧以促进复性；超滤过程中保证容器中溶液的液面恒定，缓冲液加完后继续超滤至规定体积；离心收集上清，用5-50mmol/L NaAc-HAc等倍稀释，得离子交换上样液。所述步骤 4) 精纯：经离子交换层析、疏水层析、超滤脱盐、离子交换层析Ⅱ、分子筛层析，获得重组人粒细胞刺激因子原液，具体实施步骤为：A）离子交换层析填料CM Sepharose FF，用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液平衡层析柱至流出液与平衡液pH相同；将离子交换上样液上样，上样结束后用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液平衡至基线，再用用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液进行预洗脱，洗脱完毕后，用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液平衡至流出液pH与平衡液pH相同，然后用5-50mmol/L NaAc-HAc 0.2-0.8mol/L NaCl缓冲液洗脱，并收集洗脱峰；B）疏水层析用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液将量取好的离子交换收集液稀释，在搅拌状态下加入10-100mmol/L Tris-HCl、 1.0-3.0mol/L (NH4)2SO4溶液,制成疏水上样液，(NH4)2SO4终浓度为0.3-0.7mol/L，等待上样；填料Phenyl sepharose High performance，用0.5mol/L NaOH溶液处理完毕后，再用10-100mmol/L Tris-HCl溶液冲洗至流出液电导与10-100mmol/L Tris-HCl溶液一致，最后用10-100mmol/L Tris-HCl 0.3-0.7mol/L(NH4)2SO4溶液平衡，至流出液电导与平衡液相同；将疏水层析上样液上样，上样结束后以10-100mmol/L Tris-HCl 、0.3-0.7mol/L(NH4)2SO4溶液进行平衡，平衡至流出液电导率与平衡液一致；用20mM Tris-HCl 0.2M硫酸铵溶液预洗脱，预洗至流出液电导率与20mM Tris-HCl、0.2M(NH4)2SO4溶液一致，用10-100mmol/L Tris-HCl、 0.01-0.15mol/L(NH4)2SO4溶液进行洗脱，收集洗脱峰；C）超滤脱盐将疏水层析洗脱峰，用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液进行超滤脱盐，至电导率≤1500μs/cm，用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液稀释后，得离子交换II上样液；D）离子交换层析II填料CM Sepharose FF，用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液平衡层析柱至流出液与平衡液pH相同；将离子交换II上样液上样，上样结束后用5-50mmol/L NaAc-HAc缓冲液平衡至基线，然后5-50mmol/L NaAc本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法，该方法包括以下步骤：1）选用工程菌大肠杆菌JM109做菌株进行种子液培养，该菌种来源于A.T.C.C；2）收集种子液培养、发酵和菌体；3）粗纯：对包涵体收集、洗涤、变性、复性、离子交换上样液制备；4）精纯：经离子交换层析 、疏水层析、超滤脱盐、离子交换层析Ⅱ、 分子筛层析，获得重组人粒细胞刺激因子原液；5）原液的保存。

【技术特征摘要】
1.制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法，该方法包括以下步骤：1）选用工程菌大肠杆菌JM109做菌株进行种子液培养，该菌种来源于A.T.C.C；2）收集种子液培养、发酵和菌体；3）粗纯：对包涵体收集、洗涤、变性、复性、离子交换上样液制备；4）精纯：经离子交换层析 、疏水层析、超滤脱盐、离子交换层析Ⅱ、 分子筛层析，获得重组人粒细胞刺激因子原液；5）原液的保存。2.如权利要求1所述的制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法，所述步骤 2） 收集种子液培养、发酵和菌体，具体实施步骤为：A）将冻存的种子液解冻，接种100μl于50ml LB培养基后，37℃±1℃进行一级种子培养；B）按1%接种量，将一级种子液接种于LB培养基后，37℃±1℃进行二级种子培养，将二级种子液按1:10接种量接种于发酵罐，进行发酵；C）控制发酵温度为37℃±1℃、pH6.8±0.2；每小时取样测OD6000.5，随菌体生长情况对转速、空气流量实施调节，进入对数生长期后，开始补加培养基，视OD值情况加入IPTG，继续培养至OD6000.5不再明显升高为止；收集发酵液，离心收集沉淀得菌体；发酵过程中表达产生重组人粒细胞刺激因子蛋白以包涵体形式存在于菌体内。3.如权利要求1所述的制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法，所述步骤 3） 粗纯：对包涵体收集、洗涤、变性、复性、离子交换上样液制备，具体实施步骤为：A）包涵体收集、洗涤粗包涵体获得洗涤：将湿菌体和10-100mmol/L Tris-HCl 溶液按1:10的比例充分搅匀，离心收集沉淀；再次按1:10的比例在收集的沉淀中加入10-100mmol/L Tris-HCl 溶液后充分搅匀，将得到的悬液进行破菌，破碎率达到95%，离心收集沉淀，得到粗包涵体；洗涤后包涵体获得：将得到的粗包涵体和10-20mmol/L Tris-HCl、2-4mol/L脲、1-5mmol/L EDTA的缓冲溶液按1:15的比例充分搅匀,离心，收集沉淀；按1:15的比例在上步得到的沉淀中加入10-60mmol/L Tris-HCl溶液后充分搅匀，离心收集沉淀，如此两次得洗涤后包涵体；B）包涵体变性和复性搅拌状态下，将包涵体重悬液加入10-100mmol/L Tris-HCl、5-9mol/L 脲、1-5mmol/L EDTA的缓冲溶液（pH8.5）中，往上述已加入包涵体的缓冲溶液内加入β-巯基乙醇，封口，继续搅拌，得到包涵体裂解液；将以上包涵体裂解液离心收集上清至无菌去热原容器中，搅拌状态下往其中缓慢加入6-10倍体积的10-100mmol/L Tris-HCl 缓冲液；对增溶完成得到的溶液用10-100mmol/L Tris-HCl 缓冲液超滤，并搅拌增氧以促进复性；超滤过程中保证容器中溶液的液面恒定，缓冲液加完后继续超滤至规定体积；离心收集上清液，用5-50mmol/L NaAc-HAc等倍稀释，得离子交换上样液。4.如权利要求1所述的制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法，所述步骤 4）精纯：经离子交换层析、疏水层析、超滤脱盐、离子交换层析Ⅱ、分子筛层析，获得重组人粒细胞刺激因子原液，具体实施步骤为：A）离子交换层析...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔宁，马玉涛，解直太，李仁振，
申请(专利权)人：山东科兴生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37