长效凝固因子及产生其的方法技术

多肽及编码其的多核苷酸，所述多肽包含附着至凝固因子羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽(CTP)。还公开了包含本发明专利技术多肽和多核苷酸的药物组合物以及使用其的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
公开了包含附着至凝固因子C末端(羧基末端)的至少ー个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽及编码其的多核苷酸。还公开了包含本专利技术多肽和多核苷酸的药物组合物及其使用方法。专利技术背景 多肽在血液、肝或者肾中易于变性或者被酶降解。因此，多肽典型具有几小时的短循环半衰期。由于其低稳定性，肽药物通常以持续的频率(sustained frequency)递送，以維持活性肽的有效血浆浓度。此外，由于肽药物通常通过输注方式施用，频繁注射肽药物导致对象相当不舒适。因此，需要延长治疗性多肽半衰期且同时維持其高药学功效的技木。这种希望的肽药物在注射进人体时也应满足如下需要增强的血清稳定性、高活性及诱导不希望的免疫应答的低可能性。不利的药物动力学如短的血清半衰期可以阻止许多原本是有希望的药物候选物的药物开发。血清半衰期是分子的经验特征，并且对于每种新的潜在药物必须进行实验确定。例如，使用较低分子量的多肽药物，生理学清除机制如肾过滤可以使得难以维持药物的治疗水平，这是由于所需的给药方案的成本或者频率。相反，在药物或者其代谢物具有毒性副作用时，病不希望其具有较长的血清半衰期。专利技术概述在一个实施方案中，本专利技术提供了多肽，其由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的一至五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另ー个实施方案中，本专利技术还提供了多核苷酸分子，其包含编码由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的一至五个促性腺激素羧基末端肽组成的多肽的编码部分。在另ー个实施方案中，本专利技术还提供了延长凝固因子的生物学半衰期的方法，所述方法包括将一至五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着于所述凝固因子的羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的生物学半衰期。在另ー个实施方案中，本专利技术还提供了改善凝固因子曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括将一至五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着于所述凝固因子羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的曲线下面积(AUC)。在另ー个实施方案中，本专利技术还提供了降低凝固因子给药频率的方法，包括将ー至五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着于所述凝固因子羧基末端的步骤，由此降低凝固因子的给药频率。在另ー个实施方案中，本专利技术还提供了在凝固因子治疗的使用中提高顺应性的方法，包括向有需要的对象提供多肽，所述多肽包含凝固因子、附着于所述凝固因子羧基末端的一至五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，由此在凝固因子治疗的使用中提高顺应性。附图简述图 I 是 rFVII-CTP 构建体(A) ,rFV 11-CTP-CTP 构建体(B)、rFIX_CTP 构建体(C)、和rFIX-CTP-CTP构建体(D)的图示。图2A是柱状图，其显示了在5μ g/ml维生素K3的存在下，由FVII-CTP变体限制稀释的克隆转染的和选择的细胞的收获物。FVII水平使用FVIIElisa(AssayPro)来量化。图2Β是柱状图，其显示了在5μ g维生素Κ3的存在下，由FVII-CTP变体限制稀释转染的和选择的细胞的收获物。FVII活性使用FVII生色活性测定(AssayPro)来量化。图2C是柱状图，其显示了在5μ g维生素K3的存在下，由FVII-CTP变体限制稀释转染的和选择的细胞的收获物。通过以活性值除以收获物FVII浓度计算。图2D的图，显示了由与正常集合(poll)的人血浆凝固活性相比的FVII、FVII-CTP和FVII-(CTP)2的凝固活性限制稀释转染的和选择的细胞的收获物。图2E 的图，显示了 FVII、FVII-CTP-CTP 和 FVII-CTP 收获物的 PK 谱。图3A是柱状图，其显示了在5μ g/ml维生素K3的存在下，由FIX-CTP和FIX-CTP-CTP变体限制稀释转染的和选择的细胞的收获物。FIX水平使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals ；cat. No. FIX-AG RU。)量化,计算的蛋白质浓度(μ g/ml)是两个独立实验的平均值。图3B显示了 FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显微照片A示出在Western-印迹中抗-FIX抗体的识别；显微照片B示出在Western-印迹中抗-Y羧化抗体的识别。A-B中的泳道I加载了含有重组FIX的样品。A-B中的泳道2加载了含有FIX-CTP收获物的样品。A-B中的泳道3加载了含有FIX- (CTP) 2收获物的样品。图4 的图显不了与;rhFIX (American Diagnostics)相比 FIX-CTP 和 FIX-(CTP) 2 收获物的对比生色活性(通过EC5tl.浓度测量)。图5 的图显不了与 rhFIX (American Diagnostics)凝固活性相比 FIX-CTP 和FIX-(CTP)收获物的凝固活性。图6的图显示了 rhFIX、FIX-CTP-CTP的收获物、和FIX-CTP收获物的PK谱。图7是柱状图，其分别显示了 FIX-CTP收获物和FIX-CTP-CTPM0D-3011及FIX-CTP-CTP_M0D-3012收获物以及M0D3012纯化的蛋白质FIX抗原水平，这是使用HumanFIX ELISA 试剂盒(Affinity Biologicals ；cat. No. FIX-AG RU。)确定的，计算的蛋白质浓度(μ g/ml)是两个独立实验的平均值。图8显示了 FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显微照片A示出考马斯蓝染色；显微照片B示出在Western-印迹中的抗-FIX抗体的识别；显微照片C示出在Western-印迹中抗-Y羧化抗体的识别。A-C中泳道I加载了含有FIX-(CTP) 2 (M0D-3012)的样品。A-C中泳道2加载了含有未结合的FIX-(CTP)2的样品。A-C中泳道3加载了含有FIX- (CTP) 2 (M0D-3012)的浓缩洗脱液的样品。图9的图显不了与人正常集合血衆和 rhFIX (American Diagnostics)相比M0D3012的对比生色活性(样品浓度/0. D.)。附图说明图10的图显示了与人正常集合血浆和rhFIX相比M0D3012的对比凝固活性。图11的图显示了纯化的M0D3012、rhFIX、FIX-CTP-CTP的收获物以及FIX-CTP的收获物的PK谱。专利技术详述在一个实施方案中，本专利技术提供了长效凝固因子以及生产和使用其的方法。在另一个实施方案中，长效凝固因子包含羧基末端肽(CTP，也称作CTP単位)。在另ー个实施方案中，包含凝固因子的长效多肽还包含人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)。在另ー个实施方案中，CTP作为对抗凝固 因子降解的保护剂。在另ー个实施方案中，CTP扩展了凝固因子的cmax。在另ー个实施方案中，CTP扩展了凝固因子的Tmax。在另ー个实施方案中，CTP扩展了凝固因子的循环半衰期。在一些实施方案中，CTP增强了凝固因子的效力。在另ー个实施方案中，本专利技术提供了延长凝固因子生物学半衰期的方法，所述方法包括将一至十个CTP附着至凝固因子羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的生物学半衰期。在另ー个实施方案中，本专利技术提供了延长凝固因子生物学半衰期的方法，包括将一至五个CTP附着至凝固因子羧基末端的步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：U·E·菲马，G·哈特，
申请(专利权)人：波洛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：