修饰的凝血因子VII制造技术

修饰凝血因子Ⅶ的催化活性位点以产生有效阻断血凝固级联的化合物。这一修饰使得凝血因子Ⅶａ实质上不能激活血浆凝血因子Ⅹ或Ⅸ。修饰的凝血因子Ⅶ的药物组合物用于治疗多种与血凝固有关的疾病。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及作为抗凝剂有用的蛋白质。更具体地说，本专利技术涉及抑制血凝固和组织因子之凝血因子VII的修饰的形式。
技术介绍
血凝固是由各种血液组分或因子的复杂的相互作用组成的过程。其最终导致产生血纤维蛋白凝块。一般来说，参与到已被称作血凝固“级联”的过程中的血液组分是酶原(proenzymes或zymogens)，在激活物作用下转化成为蛋白水解酶的酶促非活蛋白质，其本身是一种激活的凝结因子。经历了这种转化的血凝固因子被称为“活性因子”，用添加小写“a”后缀表示(例如凝血因子VIIa)。激活的凝血因子X(“Xa”)需要将凝血酶原转化成凝血酶，然后，作为形成血纤维蛋白凝块的最后阶段，凝血酶将血纤维蛋白原转化成血纤维蛋白。启动凝血因子激活作用有两种系统或途径。″内途径″指通过利用仅在血浆中存在的因子导致凝血酶形成的那些反应。一系列蛋白酶-介导的激活最终导致产生凝血因子IXa，其与凝血因子VIIIa一起使凝血因子X裂解为凝血因子Xa。在血凝固的″外途径″中，相同的蛋白水解由凝血因子VIIa和其辅因子、组织因子引起。组织因子是一种膜结合蛋白质，通常不在血浆中循环。然而，一旦脉管破坏，在钙离子和磷脂存在下，它就与凝血因子VIIa复合催化凝血因子X的激活或凝血因子IX的激活(Nemerson和Gentry，生物化学，254020-4033(1986))。在止血中两种血凝固途径的相对重要性尚不清楚，近年来发现凝血因子VII和组织因子在血凝固的调节中起着关键的作用。凝血因子VII是作为单链酶原在血液中循环的微量血浆糖蛋白。酶原是酶促非活性的(Williams等，生物化学杂志，2647536-7543(1989)；Rao等，美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，856687-6691(1988))。单链凝血因子VII在体外可以经凝血因子Xa、凝血因子XIIa、凝血因子IXa或凝血酶转化成为双链凝血因子VIIa。凝血因子Xa被认为是凝血因子VII主要的生理激活物。与几种止血中涉及的其它血浆蛋白质一样，凝血因子VII的活性依赖于维生素K，它是多谷氨酸残基的γ-羧化所需的，所述的谷氨酸残基簇集在蛋白质的氨基末端上。这些γ-羧化的谷氨酸是凝血因子VII及磷脂的与金属相关的相互作用所需的。在裂解大约位于分子中部的内肽键时出现酶原凝血因子VII向激活的双链型分子的转化。在人类凝血因子VII中，激活裂解位点在Arg152-Ile153上(Hagen等，美国科学院学报，832412-2416(1986)；Thim等，生物化学，277785-7793(1988)，两者本文一并参考)。牛凝血因子VII由类似的Arg152-Ile153键的裂解激活(Takeya等，生物化学杂志，26314868-14877，1988)。在组织因子、磷脂和钙离子存在下，双链凝血因子VIIa经有限蛋白酶解迅速激活凝血因子X或凝血因子IX。在病人中常常需要选择性阻断凝结级联。在例如肾组织断离期间或处理深部静脉血栓、分散性血管内血凝固(DIC)和许多其它疾病的治疗中，可以使用抗凝剂，例如肝素、香豆素、香豆素衍生物，2，3-二氢-1，3-茚二酮衍生物或其它药剂。例如，肝素治疗或者采用柠檬酸离子的体外治疗(美国专利4,500,309)可以用于组织断离中以预防处理过程中的凝结。肝素也可以用于在接受外科手术的病人中预防深部静脉血栓形成。然而，采用肝素和其它抗凝剂的治疗具有不期望的副作用。可供使用的抗凝剂一般通过整个身体起作用，而非在凝块位点特异性地起作用。肝素可以导致例如严重的出血。而且，由于约80分钟的半衰期，肝素被迅速从血液清除，必须频繁的给药。因为肝素充当抗凝血酶III(ATIII)的辅因子，在DIC治疗中ATIII迅速被耗尽，保持适当的肝素剂量常常是困难的，必须连续不断地监控ATIII和肝素水平。如果ATIII损耗达到极点，则肝素也是无效的。此外，延长肝素的使用也增加血小板凝固和减少血小板计数，并且与骨质疏松的发展有关。2，3-二氢-1，3-茚二酮衍生物也有毒副作用。除了以上简述的抗凝剂之外，也发现几种天然产生的蛋白质具有抗凝剂活性。例如Reutelingsperger(美国专利4,736,018)从牛主动脉和人脐静脉动脉分离了抗凝剂蛋白质。Maki等(美国专利4,732,891)公开了人胎盘来源的抗凝剂蛋白质。此外，ATIII已被建议作为治疗抗凝剂(Schipper等，Lancet 1(8069)854-856(1978)；Jordan，美国专利4,386,025；Bock等，美国专利4,517,294)。平滑肌细胞(SMCs)在脉管壁中的增殖是在脉管再构或对其它脉管损伤作出反应后形成动脉粥样硬化脉管损伤中的重要因素。例如动脉粥样硬化的治疗常常包括经血管成形术、动脉内膜切除术、减少的atherectomy、分流术移植和外科手术清理阻塞的脉管，其中，动脉粥样硬化症经导管插入术(血管成形术)、通过从动脉壁切除(动脉内膜切除术)的剥离法和采用天然或合成移植物的分流术来减轻和消除。这些方法除去脉管内皮，扰乱下面的内膜层和导致内侧SMCs死亡。这一损伤后，内侧SMC增殖并转移到内膜上，其特征性地出现在损伤后开始的几周到6个月，到覆盖的内皮层重新形成后停止。这些损伤由大约20％的细胞和80％细胞外基质组成。在大约30％或更多的接受血管成形术、动脉内膜切除术或分流术移植的患者中，内膜中的血栓形成和/或SMC增殖造成脉管的再闭塞，由此使再构性外科手术失败。这一外科手术后的脉管闭合被称为再狭窄。本领域仍然需要具有抗凝剂活性的改进的组合物，其可以以相对较低的剂量给药，不产生与抗凝剂组合物相关的不期望的副作用。通过提供特异性地在损伤位置起作用的抗凝剂，本专利技术解决了这一需要，此外，本专利技术还提供了其它相关的优点。专利技术概述本专利技术提供了包含具有抗凝剂性质的修饰的凝血因子VII的新组合物。所述的修饰的凝血因子VII组合物也抑制组织因子，该凝血因子VII顺序具有至少一种氨基酸修饰，其中选择所述的修饰，以实质上降低激活的凝血因子VII催化血浆凝血因子X或IX激活作用的能力，并由此能够抑制凝固活性。新的凝血因子VII具有被至少一个氨基酸取代修饰的活性位点，其修饰的形式能够结合组织因子，所述修饰的凝血因子VII组合物典型地是实质上纯化的的形式。当配制成药物组合物时，本专利技术的组合物在治疗患者的方法中特别有用，其可以对患有多种疾病的患者给药，以治疗血凝固相关疾病。这种修饰的凝血因子VII分子能够结合组织因子但具有实质上降低的催化凝固级联中其它因子激活作用的能力，其可以具有较长的血浆半衰期，因而与其它抗凝剂相比具有较长的抗凝剂活性。本专利技术组合物所适用的病症是通常用抗凝剂治疗的那些，例如，深部静脉血栓、肺栓塞、突发病、分散性血管内血凝固(DIC)、与革兰氏-阴性内毒素血症有关的肺和肾血纤维蛋白沉淀、以及心肌梗塞。所述的组合物可以用于抑制继发于机械性脉管损伤的脉管再狭窄，所说的机械性损伤例如囊血管成形术、动脉内膜切除术、减少的atherectomy、移植片固定模置入、激光治疗或rotablation引起的损伤。由此，所述的组合物可以用于抑制血小板沉淀和相关的疾病。因此，抑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在病人中抑制组织因子活性的方法，该方法包含用治疗有效量的包含凝血因子Ⅶ的组合物对病人给药，所说的凝血因子Ⅶ在其催化中心具有至少一种修饰，这一修饰实质上抑制修饰的凝血因子Ⅶ激活血浆凝血因子Ⅹ或Ⅸ的能力。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：凯思琳L伯克纳，拉尔斯克里斯蒂安彼得森，查尔斯E哈特，乌拉赫德内尔，克劳斯布雷恩戈德，
申请(专利权)人：酶遗传公司，新诺迪斯克公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]