ＨＰＰＣｎ蛋白，其具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品和蛋白质药物领域，具体说涉及外源性肝再生因子(hepatopoietin protein Cn，HPPCn)及其相关蛋白(hepatopoietin protein Cn related protein，HPPCnr)，这些蛋白能促进肝细胞增殖和肝脏再生，在细胞内则能抑制肿瘤细胞生长促进肿瘤细胞凋亡，具有潜在的临床应用价值。
技术介绍
肝脏是机体具有强大再生能力的脏器，有关其调控机理的研究国际上已进行百余年，但目前已知的肝再生相关生长因子如肝细胞生长因子(HGF)，转化生长因子-α(TGF-α)等，其作用均缺乏肝特异性，难以解释具有器官特异性的肝再生调控机理，因此继续寻找新的肝再生调控因子一直是该领域研究的热点。1975年，LaBrecque等首先报道大鼠再生肝组织中含有一种具有热稳定性并能够特异促进肝细胞增殖的因子。上世纪80年代中期，我们在人胎肝组织中也发现同类因子，并对其生物活性、理化性质、蛋白质纯化以及临床应用进行了系统研究。由于此类因子应用临床治疗严重肝损伤取得较好的疗效，因而备受重视，并于1995年获得美国专利。但由于其纯度未能达到氨基酸序列测定的标准，所以始终未能获得其氨基酸序列，进而认定其真正身份。与此同时，国外的多家实验室也一直致力于此类因子的分子克隆，1995年，Hagiya等从大鼠再生肝组织中分离到一种肝再生增强因子，并对其进行克隆表达，发现重组肝再生增强因子能够促进肝部分切除大鼠的肝脏再生，但缺乏体外对原代培养肝细胞和肝癌细胞的刺激活性。我国是一个肝病大国，病毒性肝炎、肝硬化与肝癌病人数在1.2亿以上，因此开发一种能够特异的促进肝细胞增殖和肝脏再生的活性因子对于治疗各种原因引起的肝损伤具有重要意义。除此以外，肝癌等恶性肿瘤的发生也已成为严重威胁人类健康的杀手之一，抑制肿瘤细胞生长或肿瘤发生也同样具有重要的社会意义。专利技术目的本专利技术在于发现并提供了一种在细胞外促进肝细胞增殖和肝脏再生，在细胞内抑制肿瘤细胞生长促进肿瘤细胞凋亡的HPPCn及其相关蛋白HPPCnr。
技术实现思路
本专利技术现已发现，肝再生因子HPPCn及其相关蛋白HPPCnr是一种在细胞外促进肝细胞增殖和肝脏再生，在细胞内抑制肿瘤细胞生长促进肿瘤细胞凋亡的细胞因子。该类因子的基本特性是分子量约28KD，对蛋白酶敏感，耐热，能够刺激正常肝细胞和肝癌细胞的DNA合成，对CCl4引起肝损伤有保护作用，而将其转染至肿瘤细胞内表达，能明显抑制肿瘤细胞生长并促进肿瘤细胞凋亡。因此，本专利技术第一方面涉及HPPCn和HPPCnr的氨基酸序列(见图1和图2)。本专利技术再一方面涉及HPPCn和HPPCnr在制备用于促进肝细胞增殖和肝脏再生的药物中的应用。本专利技术再一方面涉及HPPCn和HPPCnr在制备用于治疗各种原因引起的肝损伤的药物中的应用。本专利技术再一方面涉及HPPCn和HPPCnr蛋白在细胞内抑制肿瘤细胞生长的应用。本专利技术再一方面涉及HPPCn和HPPCnr在制备用于治疗各种肿瘤的药物中的应用。根据本专利技术，术语“肝细胞增殖”是指来源于肝脏的原代培养的实质细胞、正常肝细胞系以及肝癌细胞系细胞分裂能力的增强，主要通过检测DNA合成来检测细胞的增殖能力。根据本专利技术，术语“肝再生”是指哺乳动物肝脏受到损伤后能够自发恢复的能力。根据本专利技术，本专利技术的HPPCn可在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或动物细胞中表达。附图说明结合附图举例说明本专利技术，不构成对本专利技术的限制。图1为HPPCn的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。图2为HPPCnr的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。图3为工程菌诱导表达HPPCn及其纯化产物的鉴定。图4为工程菌诱导表达HPPCnr及其纯化产物的鉴定。图5表示HPPCn对34％肝切除小鼠的肝脏DNA合成的影响。图6表示HPPCn对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠血清中GPT/GOT的影响。下面的实施例用来进一步说明本专利技术，但并不意味着对本专利技术的任何限制。实施例1HPPCn的生产制备及其促肝细胞增殖和肝脏再生功能采用DEAE-cellulose、Source15Q等层析方法、SDS-PAGE分段回收以及MALDY-TOF和Q-TOF质谱技术，从新生小牛肝脏中纯化并鉴定了一个能够特异促进肝细胞增殖和肝脏再生的蛋白因子，即HPPCn。通过人胎肝cDNA文库筛选，获得人HPPCn cDNA序列。在基因序列两端加上BamH I和Xhol I酶切位点，构建到原核表达载体PBV220中，得到PBV220-HPPCn质粒。将其转化至大肠杆菌，42℃温度诱导表达。经离子交换、凝胶过滤得到纯度达95％以上的重组HPPCn，其氨基酸序列如图1所示。3H-TdR DNA掺入法检测HPPCn的促增殖活性，以L02正常肝细胞系为体外生物活性的检测靶细胞。取细胞悬液(5×104/ml)100μl，接种于96孔培养板中培养6小时，加入不同浓度HPPCn，继续培养20小时，每孔加1.85×104Bq3H-TdR，3小时后，进行液闪计数。结果表明重组人HPPCn能促进L02肝源细胞系的增殖，且具有明显的剂量依赖性，具体结果见表1。通过检测HPPCn对34％部分肝切除小鼠肝脏DNA合成的影响检测其在体内促进肝脏再生的作用。状态良好的的Balbc小鼠手术切除中叶肝脏，并分别于术后不同时间点尾静脉注射5mg HPPCn/kg体重或等体积的生理盐水，作用18hr后，腹腔注射15μCi/只3H-TdR，掺入2hr后处死动物。同时进行非手术组对照，即给正常小鼠静脉注射5mgHPPCn/kg体重或100μl生理盐水。掺入3H-TdR的小鼠提取肝脏基因组DNA，紫外分光光度计检测其260nm吸光度以定量DNA，液闪仪检测3H-TdR掺入量。结果如图5所示，非手术组静注HPPCn后，肝脏DNA合成明显增加，而大脑、肾脏、以及脾脏的DNA合成无变化(结果见表2)，提示重组HPPCn127蛋白能够较为特异的启动肝细胞DNA合成。肝切除组结果如图5所示，在各时间点HPPCn给药组的3H-TdR掺入量均高于生理盐水对照组(结果见图5)，提示HPPCn对能够提高肝切除后肝脏的再生能力。表1重组HPPCn蛋白对L02细胞的促增殖活性检测 表2HPPCn对正常小鼠不同器官DNA合成的影响 实施例2 HPPCn对CCl4诱导的急性肝损伤的保护作用30只状态良好的Balbc小鼠，注射1ml/kg CCl4后，随机分成3组I组为静脉注射2.5mg/kg HPPCn；II组为静注5mg/kg HPPCn组；III组为静注生理盐水对照组。每12hr注射一次，于48hr后观察血液中ALT，AST和LDH的变化。结果显示损伤后48hr小鼠血清中AST，ALT及LDH值都明显升高，但HPPCn治疗组小鼠较生理盐水组小鼠AST，ALT及LDH值均显著降低(结果见图6)，表明HPPCn对CCl4引起的急性肝损伤具有保护作用。实施例3 HPPCn细胞内抑制肿瘤细胞生长将HPPCn分别构建到真核表达载体pEGFP-N1质粒中，并将其转染至人肝癌细胞系SMMC7721中，培养36h后，分别用4％多聚甲醛和70％乙醇固定，PI染色后，FACS检测其细胞周期的变化，结果表明转本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴祖泽，石炳兴，崔春萍，杜邵君，吴丹莉，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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