一种骨骼或牙齿DNA磁珠提取方法和试剂技术

本发明专利技术公开了一种骨骼或牙齿DNA磁珠提取方法和试剂。试剂包括：0.2‑0.8M EDTA，0.3‑0.6％NLS，0.2‑0.5M EGTA，0.40‑0.70mg/ml PK，0.02‑0.05M DTT，35‑50％异丙醇，2.0‑4.0M盐酸胍，0.5‑1.5mg磁珠，5‑10mM氯化钙，70‑90％乙醇，0.5×TE。方法步骤：1.脱钙：30‑45℃处理检材；2.消化：45‑65℃裂解检材释放DNA；3.结合：室温结合DNA；4.洗涤：清洗磁珠；5.洗脱：室温或高温振荡洗脱DNA。该方法能高效地提取骨骼或牙齿DNA，满足定量定性、测序等实验及法医科学DNA分型与应用的要求。

【技术实现步骤摘要】
一种骨骼或牙齿DNA磁珠提取方法和试剂
本专利技术涉及一种骨骼和牙齿DNA磁珠提取方法和试剂，特别是针对陈旧检材，属于生物

技术介绍
在法医学DNA基因分析领域，在很多情况如：空难、恐怖袭击及多年陈旧检材的DNA分析过程中，骨头和牙齿通常是最好的但又是仅有的DNA分析资源。然而目前为止DNA的有效提取仍旧是法医分析中的DNA分型中面临的巨大难题，因为陈旧骨骼/牙齿检材长期暴露于外界环境中，如高温、潮湿、暴晒、土壤微生物等恶劣条件对DNA的产生严重破坏，导致DNA含量减少且降解程度严重，DNA分子可能被降解成很小的片段(甚至50bp以下)，此外陈旧牙齿和骨骼检材中还存在大量PCR反应抑制剂和外源性污染，而且检材的大范围钙化也会阻碍DNA的释放。另外由于检材用途的特殊性，提取方法需要快速高效且可以有效防止污染。目前我们所采用的陈旧骨骼/牙齿检材的DNA提取方法大致可分为酚/氯仿、异丙醇/氯仿等有机方法及硅胶提取等方式。这些方法中均存在着缺点，如有机提取法无法有效去除检材样本中的亲水成分和PCR抑制剂而且该方式对操作人员的健康造成伤害。而硅胶颗粒用于DNA提取其本身也是一种抑制剂。目前对于陈旧骨头和牙齿的DNA提取方法一直在发展但是仍没有高效而又统一的标准流程。目前亟需要一种快速高效并且操作简单可以尽可能减少污染的方法，以便于后续一代、二代的DNA测序和准确分型，有效运用于法医的身份鉴定。
技术实现思路
本专利技术公开了一种骨骼和牙齿DNA磁珠提取方法和试剂，特别是针对陈旧检材的DNA提取。该方法能高效、快速地获得高质量的骨骼/牙齿检材DNA，可以满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验及法医科学DNA分型及应用要求。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用的技术方案是：1.步骤一：骨骼或牙齿DNA磁珠提取方法试剂配制预处理脱钙液A：0.2-0.8M乙二胺四乙酸(EDTA)；消化液B：0.3-0.6％(w/v)N-月桂酰肌氨酸钠盐(NLS)，0.2-0.5M乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.40-0.70mg/ml蛋白酶K，0.02-0.05M，二硫苏糖醇(DTT)；磁珠悬浮液：15-30％(w/v)纳米磁珠；结合液C：35-50％(v/v)异丙醇，2.0-4.0M盐酸胍，0.5-1.5mg磁珠；洗涤液W1：5-10mM氯化钙，70-90％(v/v)乙醇，洗涤液W2：70-90％(v/v)乙醇；洗脱液T：0.5×TE(Tris-EDTA)，pH＝7.0-9.0。2.步骤二：对骨骼或牙齿检材进行脱钙预处理取骨骼或牙齿检材粉末1.0g置于15ml离心管中，加入脱钙预处理液A，在30-45℃条件下于旋转混合仪中避光处理1.0-2.0小时，脱钙预处理液A：0.2-0.8M乙二胺四乙酸(EDTA)。由于骨骼和牙齿检材存在大范围钙化情况，会阻碍提取试剂的进入和检材细胞中DNA的释放，因此需通过脱钙的方式破坏钙化结构，使提取试剂更好的进入细胞，破坏细胞结构有助于细胞内DNA的释放提高提取效果。3.步骤三：对检材进行消化裂解处理将脱钙预处理的样品3000-4000g左右离心3min去上清，向其中加入消化液B，快速振荡60s使其混匀，然后在旋转混合仪中45-65℃条件下避光处理1.0-2.0小时。消化液B：0.3-0.6％(w/v)N-月桂酰肌氨酸钠盐(NLS)，0.2-0.5M乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.40-0.70mg/ml蛋白酶K，0.02-0.05M二硫苏糖醇(DTT)。N-月桂酰肌氨酸钠盐是阴离子表明活性剂且具有渗透、乳化、增溶等作用，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)类似于乙二胺四乙酸(EDTA)起到螯合剂的作用，但与EDTA不同它不会对后续的分子测序产生抑制作用。蛋白酶K降解蛋白使DNA裸露，DTT起到抗氧化作用。该组合方式可以有效的裂解细胞去除蛋白等杂物，充分释放DNA。4.步骤四：结合从检材中释放的DNA上一步消化处理的样本冷却至室温后，4000-6000g离心4min，将上清转移到新的15ml离心管内，加入结合液B；漩涡振荡15-30秒；加入适量醋酸调节PH至4.0-9.0，加入15ul已悬浮磁珠液体，在室温条件下避光反应0.5-2.0小时；从旋转混合仪中取出离心管，将离心管放在磁力架上，静置1-2分钟进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠。结合液C：35-50％(v/v)异丙醇，2-4M盐酸胍。高浓度胍盐可以使蛋白降解，核酸酶失活有助于加速DNA与磁珠的结合。5.步骤五：洗涤结合在磁珠上的DNA首先盐洗涤，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W1900ul，漩涡振荡30-60秒；静置1-2分钟后将离心管放在磁力架上，静置1-2分钟进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，同上述步骤使用800ul洗涤液W1再洗涤一次，保留磁珠；然后进行醇洗涤，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W21.0ml，漩涡振荡30-60秒；静置1-2分钟后将离心管放在磁力架上，静置1-2分钟后进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞开管口45-60℃eppendorf震荡孵育器内放置5分钟以便乙醇挥发。洗涤液W1：5-10mM氯化钙，70-90％(v/v)乙醇；洗涤液W2：70-90％(v/v)乙醇。盐洗和醇洗可以分别去除盐类及有机物杂质，45-60℃挥发可以去除乙醇，有利于后续进一步的分子定量测序分析等。6.步骤六：将结合在磁珠上的DNA洗脱向完成第二步洗涤、去除上清、留有磁珠的离心管中加入25-50ul洗脱液T，将离心管50-65℃低速1000-1200rpm漩涡振荡5分钟，计时结束后，取出离心管，将离心管放在磁力架上，静置1-2分钟进行磁性分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的骨骼/牙齿检材DNA。洗脱液T：0.5XTE(Tris-EDTA)，pH＝7.0-9.0。漩涡震荡、加热的物理强化作用易于DNA的洗脱，TE(Tris-EDTA)缓冲液为弱碱性，对DNA的碱基有保护性，易于提取DNA的保存。以上基于一种骨骼或牙齿检材磁珠DNA提取方法，包括检材的脱钙预处理、消化液裂解细胞释放DNA、磁珠与DNA结合、磁珠上DNA洗涤、DNA洗脱。7.作为优选的，本专利技术在脱钙预处理过程中，为保证漩涡振荡混匀的效果，所提取的骨骼/牙齿检材粉末(以克为单位)与脱钙液(以毫升为单位)的比例满足1:5-1:15，所使用的样本起始量不得超过1.0g，一般使用15ml离心管即所使用离心管最大装液量的2/3；若大量提取时，使用50ml离心管。8.作为优选的，本专利技术在脱钙预处理过程中，脱钙预处理条件为：骨骼/牙齿检材于混悬仪上30-45℃避光处理1.0-2.0小时。9.作为优选的，本专利技术在消化过程中，消化液B的用量(以毫升为单位)是样本起始量(以克为单位)的4-6倍，每1.0g样本中蛋白酶K的使用量为250-400ul(20mg/ml)，双硫苏糖醇的使用量为400-500ul(1M)。10.作为优选的，本专利技术在消化过程中，消化的条件为：于混悬仪上45-65℃条件下避光处理1.0-2.0小时。11.作为优选的，本专利技术在结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种骨骼和牙齿DNA磁珠提取方法和试剂，具体流程包括试剂配制和方法操作：(1)试剂配制：包括脱钙液、消化液、结合液、洗涤液和洗脱液的配制；(2)脱钙液A预处理，将用液氮处理后研磨成粉末的骨骼/牙齿样本，作为DNA提取样品。取陈旧骨骼/牙齿检材粉末样品置于离心管中，加入预处理液A，对骨骼/牙齿检材在30‑45℃条件下于旋转混合仪中避光进行脱钙预处理1.0‑2.0小时；(3)消化液B裂解，在避光45‑65℃条件下对样本进行消化裂解处理释放DNA；(4)结合液C结合DNA，避光室温条件下采用磁珠特异性吸附样本中的DNA；(5)洗涤，配置洗涤液W1和W2对吸附DNA的磁珠进行洗涤；(6)加入洗脱液T，在室温或高温作用下辅助洗脱，经过充分混合洗脱后，进行磁珠分离，然后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的骨骼/牙齿检材DNA，所述的物理强化作用为漩涡震荡、加热组合的方式。

【技术特征摘要】
1.一种骨骼和牙齿DNA磁珠提取方法和试剂，具体流程包括试剂配制和方法操作：(1)试剂配制：包括脱钙液、消化液、结合液、洗涤液和洗脱液的配制；(2)脱钙液A预处理，将用液氮处理后研磨成粉末的骨骼/牙齿样本，作为DNA提取样品。取陈旧骨骼/牙齿检材粉末样品置于离心管中，加入预处理液A，对骨骼/牙齿检材在30-45℃条件下于旋转混合仪中避光进行脱钙预处理1.0-2.0小时；(3)消化液B裂解，在避光45-65℃条件下对样本进行消化裂解处理释放DNA；(4)结合液C结合DNA，避光室温条件下采用磁珠特异性吸附样本中的DNA；(5)洗涤，配置洗涤液W1和W2对吸附DNA的磁珠进行洗涤；(6)加入洗脱液T，在室温或高温作用下辅助洗脱，经过充分混合洗脱后，进行磁珠分离，然后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的骨骼/牙齿检材DNA，所述的物理强化作用为漩涡震荡、加热组合的方式。2.根据权利要求1所述的一种骨骼和牙齿DNA磁珠提取方法和试剂，其DNA提取试剂配方特征是：预处理脱钙液A：0.2-0.8M乙二胺四乙酸(EDTA)；消化液B：0.3-0.6％(w/v)N-月桂酰肌氨酸钠盐(NLS)，0.2-0.5M乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.40-0.70mg/ml蛋白酶K，0.02-0.05M二硫苏糖醇(DTT)磁珠悬浮液：15-30％(w/v)纳米磁珠；结合液C：35-50％(v/v)异丙醇，2.0-4.0M盐酸胍，0.5-1.5mg磁珠；洗涤液W1：5-10mM氯化钙，70-90％(v/v)乙醇；洗涤液W2：70-90％(v/v)乙醇；洗脱液T：0.5×TE(Tris-EDTA)，pH＝7.0-9.0。3.根据权利要求1所述的一种骨骼和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，刘琪琦，刘丽艳，张敏丽，周喆，张庆珍，丁晓然，王琼，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11