尿液ctDNA中EGFR基因突变位点的检测制造技术

本发明专利技术提出了尿液ctDNA中EGFR基因突变位点的检测，具体提出了从尿液样本中分离ctDNA的方法、基于尿液样本构建测序文库的方法、测序文库、基于尿液样本进行核酸测序方法、用于从尿液样本中分离ctDNA的设备以及确定个体药物敏感性的系统。从尿液样本中分离ctDNA的方法包括：向尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；将混合液进行离心处理，收集上清液；将上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；将浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及将洗脱液进行纯化处理，以便得到ctDNA。本发明专利技术能够从大量尿液样本中快速、大量地提取出ctDNA，并能够对其进行核酸测序，还可以确定个体药物敏感性，从而提高了尿液ctDNA的应用前景。

Detection of mutation site of EGFR gene in urine ctDNA

The invention proposed the detection of EGFR gene mutation loci in urine ctDNA, specifically proposed the method of separating ctDNA from urine samples, method of constructing sequencing Library Based on urine samples, sequencing library, nucleic acid sequencing based on urine samples, equipment for separating ctDNA from urine samples, and determining individual drug. A sensitive system. The methods of separating ctDNA from urine samples include: adding the EDTA to the urine sample in order to get the first mixture, centrifuging the mixture and collecting the supernatant, concentrating the supernatant to get the concentrate, and mixing the concentrated solution with the anion exchange resin to get the second mixture. The second mixed liquor was chromatograph and separated to obtain eluent, and the eluent was purified to obtain ctDNA. The invention can quickly and greatly extract ctDNA from a large number of urine samples, and can sequence the nucleic acid of the urine, and can also determine the sensitivity of the individual drug, thus improving the prospect of the application of urine ctDNA.

【技术实现步骤摘要】
尿液ctDNA中EGFR基因突变位点的检测
本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及尿液ctDNA中EGFR基因突变位点的检测。
技术介绍
循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)是由肿瘤细胞释放到循环系统如血液中的基因组小片段，其来源于机体所有肿瘤部位，具有含量极低、个体间差异大、半衰期短、匀质性、携带有肿瘤特异性遗传学/表观遗传学变异等特点。这些来自肿瘤基因组的DNA片段会携带一定的特征，包括突变，缺少，插入，重排，拷贝数异常及甲基化等。然而，目前对于ctDNA的获得方式及其应用仍有待开发。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提出了一种从尿液样本中分离ctDNA的方法、基于尿液样本构建测序文库的方法、测序文库、基于尿液样本进行核酸测序方法、用于从尿液样本中分离ctDNA的设备以及确定个体药物敏感性的系统。本专利技术能够从大量尿液样本中快速、大量地提取出ctDNA，并能够对其进行核酸测序，还可以确定个体药物敏感性，从而提高了尿液ctDNA的应用前景。为此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种从尿液样本中分离ctDNA的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：向所述尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；将所述第一混合液进行离心处理，收集上清液；将所述上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；将所述浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将所述第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。专利技术人发现，采用离子交换层析方法能够快速、大量地分离得到尿液样本中的ctDNA。根据本专利技术的实施例，上述从尿液样本中分离ctDNA的方法还可以具有下列附加技术特征：根据本专利技术的实施例，所述方法包括：向110毫升所述尿液样本中加入终浓度为10mmoL/L的EDTA，以便得到第一混合液；将所述第一混合液在18～23℃的温度、1800g的转速下离心10分钟，收集上清液；将所述上清液浓缩至4毫升，以便得到浓缩液；将所述浓缩液与750微升Q琼脂糖阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将所述第二混合液进行色谱柱洗脱处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。专利技术人发现，离心处理条件、浓缩体积及其与阴离子交换树脂的用量比会影响提取效果。进而，专利技术人经过大量实验发现，将混合液在18～23℃的温度、1800g的转速下离心10分钟，能够有效地取出细胞碎片、杂质。接着，由于尿液样本中ctDNA含量相对较低，进而通过将含有ctDNA的上清液浓缩至4毫升，所得到的浓缩液中ctDNA含量较高，便于后续对ctDNA的利用。进一步地，专利技术人经过大量实验发现，采用Q琼脂糖阴离子交换树脂进行离子交换层析，能够有效地吸附ctDNA，从而提高ctDNA的提取率。另外，基于4毫升的浓缩液，阴离子交换树脂的用量为750微升，在这两者用量比的条件下，能够充分吸附ctDNA，若阴离子交换树脂的用量过少，会有少量ctDNA未被吸附、收集，若阴离子交换树脂的用量过多，提高分离成本。此外，EDTA的添加能够抑制核酸酶的活性，防止其将ctDNA降解。然而，其他离心处理条件、浓缩体积及其与树脂的用量比的效果不佳。由此，根据本专利技术实施例的从尿液样本中分离ctDNA的方法进一步快速、大量地分离得到尿液样本中的ctDNA。在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种基于尿液样本构建测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：基于尿液样本，按照前面从尿液样本中分离ctDNA的方法分离ctDNA；对所述ctDNA进行扩增，以便获得扩增产物；以及在所述扩增产物的末端添加接头序列，以便获得连接产物，所述连接产物构成所述测序文库。专利技术人发现，利用前面从尿液样本中分离ctDNA的方法分离ctDNA，以ctDNA作为模板，构建测序文库，由此可以实现对ctDNA的分析。根据本专利技术的实施例，采用特异性识别所述ctDNA突变位点的引物及探针进行所述扩增，所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：1～4所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：5～8所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：9～12所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：13～16所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：17～20所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：21～24所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：25～28所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：29～32所示的核苷酸序列。EGFR是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。专利技术人经过大量实验得到上述引物序列，该8对引物及探针分别针对EGFR基因(具体序列参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000007.14？report＝fasta&from＝55019032&to＝55207338)中的7个突变位点的目标区域设计的，能够特异性地结合到突变位点，以便对其进行扩增，便于后续检测、分析需要。需要说明的是，可以根据实际需要选择任意一对引物及探针或者多对引物及探针进行扩增，例如针对单突变位点的研究，可以仅扩增所需突变位点的目标区域；针对多突变位点的研究，可以选择多对引物及探针，在一个或者多个扩增体系中实现目标区域的扩增。表1引物及探针的核苷酸序列根据本专利技术的实施例，采用数字PCR进行所述扩增，基于50微升的PCR反应体系，所述PCR反应体系包括：25μL的1×DNA聚合酶；2μL的1×油滴稳定剂；2μL的12.5μM的正向引物；2μL的12.5μM的反向引物；2μL的5μM的正向探针；2μL的5μM的反向探针；1～15μL的所述尿液ctDNA，所述尿液ctDNA预先用5ng/μL的carrierRNA进行稀释；以及剩余的双蒸水。数字PCR一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。专利技术人以ctDNA为模板，将PCR反应体系利用RainDropSource(RainDanceTechnologies)系统将单个分子分散至油包水液滴中，制备好的油滴经第一步PCR扩增捕获目标区域，破坏油滴释放扩增子，再通过第二步PCR添加适用于illumina测序平台的接头序列，磁珠法纯化DNA。专利技术人经过大量实验得到较佳的PCR反应体系，由此，能够快速、准确地扩增捕获目标区域。其中，由于ctDNA含量较少，容易挂在反应管壁上，carryRNA能够增大体系中的核酸浓度，使得相同体积的挂壁液体中大部分是carryRNA，有利于ctDNA的富集反应，而且carryRNA不会对下一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从尿液样本中分离ctDNA的方法，其特征在于，包括：向所述尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；将所述第一混合液进行离心处理，收集上清液；将所述上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；将所述浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将所述第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。

【技术特征摘要】
1.一种从尿液样本中分离ctDNA的方法，其特征在于，包括：向所述尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；将所述第一混合液进行离心处理，收集上清液；将所述上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；将所述浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将所述第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：向110毫升所述尿液样本中加入终浓度为10mmoL/L的EDTA，以便得到第一混合液；将所述第一混合液在18～23℃的温度、1800g的转速下离心10分钟，收集上清液；将所述上清液浓缩至4毫升，以便得到浓缩液；将所述浓缩液与750微升Q琼脂糖阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将所述第二混合液进行色谱柱洗脱处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。3.一种基于尿液样本构建测序文库的方法，包括：基于尿液样本，按照权利要求1或2所述的方法分离ctDNA；对所述ctDNA进行扩增，以便获得扩增产物；以及在所述扩增产物的末端添加接头序列，以便获得连接产物，所述连接产物构成所述测序文库。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用特异性识别所述ctDNA突变位点的引物及探针进行所述扩增，所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：1～4所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：5～8所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：9～12所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：13～16所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：17～20所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：21～24所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：25～28所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQIDNO：29～32所示的核苷酸序列，任选地，采用数字PCR进行所述扩增，基于50微升的PCR反应体系，所述PCR反应体系包括：25μL的1×DNA聚合酶；2μL的1×油滴稳定剂；2μL的12.5μM的正向引物；2μL的12.5μM的反向引物；2μL的5μM的正向探针；2μL的5μM的反向探针；1～15μL的所述尿液ctDNA，所述尿液ctDNA预先用5ng/μL的carrierRNA进行稀释；以及剩余的双蒸水。5.一种测...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈谦，张建民，李新新，贾海雪，刘芳，周瑜，
申请(专利权)人：索真北京医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11