一种胎盘因子及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种胎盘因子及其制备方法与应用。该胎盘因子可按照以下方法制备：１）将胎盘剪碎，进行离心力为１７７０～２９９１．３ｇ的组织匀浆，将得到的匀浆液置于２５－４０℃水浴中孵育０．５～２．５小时后，在４－１０℃１１３．２８～３９８．２５ｇ离心２０～４０分钟，取上清液；２）将步骤１）得到的上清液进行截留分子量为１０ＫＤ的超滤，得到的超滤产物即为胎盘因子。本发明专利技术制备ＰＦ的方法，原料丰富，制备方法简单，稳定性好。本发明专利技术的胎盘因子是从人胎盘组织中提取的小分子多肽类物质，副作用小，使用安全，具有广泛的应用前景，可在器官移植及造血干细胞移植中用于预防和／或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种胎盘因子及其制备方法与应用。
技术介绍
移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是造血干细胞移植后常见的合并症，是限制移植成功的主要障碍。当前所应用的免疫抑制剂(如糖皮质激素、FK506、环孢素A及骁悉等)以及去除移植物中T细胞的各种方法虽然可以减轻GVHD，但是上述这些方法却提高了机会性感染、白血病复发和移植失败的发生率，并且还伴随有药物毒副作用。因此，寻找控制GVHD的新方法一直是血液学界关注的重要问题，也是移植免疫学研究的热点与难点之一。胎儿与母体是不同的个体但却能共存而不发生免疫排斥，这一现象提示我们胎盘中可能含有某种成分可以使胎儿和母体产生免疫耐受。国内学者以人胎盘组织为原料，从胎盘中提取了小分子的多肽类物质即胎盘因子(placenta factor，PF)。目前，PF的提取方法主要有两种。一是透析法胎盘剪碎，高速匀浆，经反复冻融(-30℃至40℃反复3次)、高速离心(3000r/min，25min)后，取上清液透析48小时，过滤除菌得到PF；二是超滤法胎盘剪碎，加2倍生理盐水，组织匀浆，经高速离心(8000r/min，20min)，取上清液进行超滤得到PF。理化性质研究发现PF外观呈微黄色透明液体，蛋白质定性反应呈阴性，是一种小分子多肽类物质的混合物，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其分子量为3000-5000D。进一步的生物学活性研究发现，PF在体外可以促进T淋巴细胞表面绵羊红细胞受体的恢复、促进PHA诱导的T淋巴细胞增殖、促进淋巴细胞分泌IL-2及淋巴细胞表面IL-2受体的表达；动物体内实验亦发现PF可以增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能、增强NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤、增强PHA诱导的T淋巴细胞增殖能力。同时一些学者将其用于治疗恶性肿瘤、病毒性肝炎、支气管哮喘及变应性鼻炎等病也获得了良好的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胎盘因子及其制备方法。本专利技术所提供的胎盘因子，可按照以下方法制备1)将胎盘剪碎，进行离心力为1770～2991.3g(10000～13000转/min)的组织匀浆，将得到的匀浆液置于25-40℃水浴中孵育0.5～2.5小时后，在4-10℃13.28～398.25g(800～1500转/min)离心20～40分钟，取上清液； 2)将步骤1)得到的上清液进行截留分子量为10KD的超滤，得到的超滤产物即为胎盘因子。所述胎盘组织可在生理盐水中匀浆。所述组织匀浆的离心力优选为2548.8g(12000转/min)。所述匀浆液优选置于37℃水浴中孵育1小时。所述匀浆液孵育后在4-10℃113.28g(800转/min)离心30分钟。所述胎盘为人胎盘。上述方法中，还包括将步骤2)得到的胎盘因子进行灭菌处理的步骤，如将超滤产物进行220μm孔径的过滤除菌。本专利技术制备的PF外观呈微黄色透明液体，pH 6.5～7.5，蛋白质定性呈阴性，Bradford法测定多肽质量为5.7～6.9mg/g鲜重胎盘，SDS-PAGE法测定结果表明本专利技术制备的PF主要含有两种成分，分子量分别为9.187KD及4.794KD。本专利技术的另一个目的是提供一种预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病的药物。本专利技术所提供的预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病的药物，它的活性成分为本专利技术制备的胎盘因子。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。所述预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病的药物可通过注射方法导入机体。在本专利技术的制备方法中，增加了37℃孵育的步骤，并降低了离心转速(由以往的高速离心(如8000转/分钟)降至800转/分钟)，这与以往的方法不同。本专利技术的PF外观呈微黄色透明液体，pH 6.5～7.5，蛋白质定性呈阴性，Bradford法测定多肽质量为5.7～6.9mg/g鲜重胎盘，这与以往文献报道相似。但SDS-PAGE显示本专利技术制备的PF主要含有两种成分，分子量分别为9.187KD及4.794KD，这与既往文献报道不同(以往报道的PF是分子量小于5KD的多肽混合物)。这可能是因为37℃孵育及低速离心更有利于保留PF中分子量较高的活性成分。另外通过对其生物学活性的研究，也证实本专利技术制备的PF具有与以往不同的生物学活性。其在体内体外对T淋巴细胞均具有强大的免疫抑制作用，PF体内应用后，并没有明显的T淋巴细胞去除作用，而是通过降低T细胞的增殖和活化能力、诱导CD4+CD25+调节性T细胞及CD8+CD28-抑制性T细胞的产生、调节Th1/Th2细胞因子的分泌等多种途径诱导机体免疫耐受，其作用强于传统的免疫抑制剂环孢素A。同时，PF可以提高体内NK细胞及NKT细胞的数量，并促进NK细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤。随后，在小鼠异基因骨髓移植模型中，也进一步证实PF可以预防GVHD的发生、减轻GVHD的严重程度、降低移植小鼠的死亡率，另外PF体内应用还有助于移植小鼠供者造血细胞及淋巴细胞的植入，且上述作用均明显强于环孢素A。这些结果提示，PF在诱导免疫耐受的同时，不会影响移植后的免疫重建，并且可能通过提高NK细胞的杀伤活性，以及NK细胞和NKT细胞的数量来保留机体对病原体及肿瘤的抵抗力，同时还可以促进供者造血及淋巴细胞的植入，这将为提高临床器官移植及造血干细胞移植的效果提供新的途径。本专利技术制备PF的方法，原料丰富，制备方法简单，稳定性好。本专利技术的胎盘因子是从人胎盘组织中提取的小分子多肽类物质，副作用小，使用安全，具有广泛的应用前景，可在器官移植及造血干细胞移植中用于预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病(GVHD)。附图说明图1为PF的SDS-PAGE电泳结果图2为PF对PHA诱导的淋巴细胞增殖的影响结果图3为PF对混合淋巴细胞反应的影响结果图4为PF对T细胞CD69表达的影响结果图5为PF对NK细胞杀伤肿瘤细胞的影响结果图6为PF对小鼠体重的影响结果图7为PF对小鼠外周血白细胞的影响结果图8为PF对ConA及异基因抗原诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响结果图9为PF对T细胞、CD4+及CD8+T细胞数量及CD4+/CD8+T细胞比值的影响结果图10为PF对小鼠脾脏T细胞及其各亚群CD28表达的影响结果图11为PF对小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞和CD8+CD28-抑制性T细胞数量的影响结果图12为PF对小鼠脾脏NK细胞及NKT细胞数量的影响结果图13为PF对MLR培养上清中IFN-γ及IL-4的影响结果图14为骨髓移植后各组小鼠GVHD的发生率图15为骨髓移植后各组小鼠的生存曲线图16A为三组小鼠GVHD发生时间及发病例数的比较图16B为三组小鼠死亡时间及死亡例数的比较图17A为骨髓移植后各组小鼠体重的变化图17B为骨髓移植后各组小鼠外周血白细胞计数的变化图18为三组小鼠供者造血细胞及淋巴细胞的植入情况图19为三组小鼠肝脏及小肠病理改变的100倍HE染色照片具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、胎盘因子(placenta fa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备胎盘因子的方法，包括以下步骤：　　　　１）将胎盘剪碎，进行离心力为１７７０～２９９１．３ｇ的组织匀浆，将得到的匀浆液置于２５－４０℃水浴中孵育０．５～２．５小时后，在４－１０℃１１３．２８～３９８．２５ｇ离心２０～４０分钟，取上清液；　　　　２）将步骤１）得到的上清液进行截留分子量为１０ＫＤ的超滤，得到的超滤产物即为胎盘因子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：闫晨华，陆道培，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]