【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫治疗，具体涉及一种ra自身抗原表位多肽及其制备的抗原特异性t细胞疫苗、制备方法和应用。
技术介绍
1、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是临床最常见的高致残性自身免疫病，该病的患病率是0.28％～0.41％，而缓解率仅为8.6％，未经正规治疗致残率高达75％，是我国致残率最高的疾病之一。类风湿关节炎的特点包括出现炎症性滑膜增生、慢性破坏性关节炎以及产生各类自身抗体(如类风湿因子、抗瓜氨酸化抗体等)，致使关节功能障碍和畸形，可累及心、肺、肾、神经等全身脏器。目前ra的治疗主要通过非甾体抗炎药(nsaids)和缓解病情抗风湿药(dmards)联合糖皮质激素进行一线治疗，但仅仅只有40％～50％的病人对于该治疗有响应。进一步联合生物制剂(如tnf抑制剂和jak抑制剂)治疗，约70％的ra患者达到临床缓解或处于低疾病活动状态。目前我们仍面临缺乏ra特异性治疗手段的严峻形势，开发更安全有效的药物治疗实现ra个体化精准治疗是临床实践中亟待解决的问题。
2、自身抗原驱动的t异常细胞活化是ra发病中的关键因素，在内源性或者外源性因素影响下，导致机体对于某些自身抗原的反应性增强，促进自身抗原肽及hla-drb1与tcr特异性识别与结合，活化致病性的抗原特异性t细胞，从而介导慢性炎症反应。患者关节炎症部位，通过细胞接触与可溶性介质释放，抗原特异性t细胞刺激巨噬细胞和滑膜成纤维细胞，产生破坏骨和软骨的炎性介质和蛋白酶，促进关节炎症。同时抗原特异性t细也促进b细胞产生大量类风湿因子和抗环瓜氨酸蛋
3、靶向t细胞的药物和技术在临床获得成功，以ctla4融合蛋白abatacept(阿巴西普)为代表的t细胞活化抑制疗法是目前较为成熟的方案，通过与抗原提呈细胞表面的cd80/cd86结合，阻止cd80/cd86与t细胞表面cd28的相互作用，从而抑制自身抗原诱导的t细胞活化、减弱其下游炎症反应，从而抑制破骨细胞生成发挥治疗作用。此外，目前已有多种t细胞相关的细胞因子融合蛋白或者单抗在临床上用于治疗类风湿关节炎。此外jak1/2/3抑制剂能够同时抑制多种炎性细胞因子的功能，目前jak抑制剂tofacitinib在临床应用中病人有良好获益。然而上述方案均是无差别地阻断t细胞活化以及下游炎症、进行治疗，可能会导致广谱的免疫抑制，攻击发挥保护功能的效应细胞，不可避免地引起感染、消化道、肝肾损伤等副作用。在这样的治疗现状下，亟需我们加快寻找一种更安全有效的治疗手段控制疾病发生发展，纠正ra患者紊乱的免疫系统，实现ra患者个体化精准治疗。
4、目前以“免疫平衡恢复”作为治疗目标已得到免疫学专家和临床研究者的重视，包括使用治疗性疫苗达到免疫平衡恢复，t细胞疫苗作为一类细胞疫苗已在多种免疫病中发挥疗效。t细胞疫苗与减毒疫苗概念类似，是指通过处理灭活致病性t细胞，使其丧失致病性，但保留致病性t细胞的免疫特征，以期诱导免疫耐受发挥治疗效果。t细胞疫苗是近年来精准医疗的新方向，与传统疫苗只要通过体液免疫发挥作用不同，细胞疫苗可以同时调动细胞免疫与体液免疫。而与目前大热的car-t技术相比，car-t只靶向表达某一特定细胞亚群，而t细胞疫苗既能靶向多种自身反应性致病细胞，也能诱导免疫耐受，调节免疫系统恢复平衡，而这对自身免疫病的患者至关重要。前期t细胞疫苗在自身免疫病中的使用采用的是非靶向性扩增，并未分离其中具体细胞亚群，因而治疗效果有限，疗效有待进一步提高。
5、此外，免疫细胞通常难以识别整个抗原分子，而是通过表面受体识别抗原大分子的特定部分序列即抗原表位。抗原表位是抗原分子中主要的功能单位，能有效刺激机体的细胞免疫与体液免疫。目前t细胞的抗原表位通常为线性表位，确定是否为t细胞的表位需要预测该多肽与hla结合亲和力强弱，以及利用t细胞增殖实验，酶联免疫吸附实验等确定活性。不同表位对应的自身抗原多肽的刺激效果差异较大，影响t细胞的活化及功能。由于旁观者耐受效应，尽管在类风湿关节炎中存在多种自身抗原参与发病机制，选择一种关键抗原诱导免疫耐受便可调节免疫系统恢复平衡。目前还未有利用自身抗原表位刺激t细胞增殖后产生抗原特异t细胞，并经这部分细胞分离用于制备抗原特异t细胞疫苗相关的报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种ra类风湿关节炎自身抗原表位多肽，改造以延长其半衰期，提高免疫激活作用，达到特异刺激ra样本来源的外周抗原特异的cd4+增殖，并在il-7与il-15联合处理后增强其对自身抗原多肽反应性，利用抗原提呈细胞结合抗原多肽进一步促进其增殖最后利用il-2与pha获得目的细胞大量增殖的效果。
2、本专利技术的目的在于提供一种抗原特异性t细胞疫苗，通过免疫抑制调节性t细胞发挥作用，来实现治疗因全身免疫系统紊乱导致的关节病变。
3、本专利技术的目的还在于提供一种抗原特异性t细胞疫苗的制备方法，具有促进抗原特异t细胞快速增殖特点的同时还进行分离处理，获得高纯度抗原特异性t细胞疫苗后灭活制备抗原特异性t细胞疫苗。
4、本专利技术的目的还在于提供一种抗原特异性t细胞疫苗在制备类风湿关节炎药物中的应用。
5、本专利技术提供了一种类风湿关节炎自身抗原表位多肽，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的n端谷氨酰胺替换为d型谷氨酰胺，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的n端进行乙酰胺化修饰，同时所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的c端进行酰胺修饰。
6、本专利技术提供了一种抗原特异性t细胞疫苗，类风湿性关节炎样本来源的脾细胞经所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽刺激后灭活分离得到。
7、优选的，所述抗原特异性t细胞疫苗为灭活的抗原特异cd4+t细胞。
8、本专利技术提供了所述抗原特异性t细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：
9、将类风湿性关节炎样本来源的脾细胞或外周pbmc细胞在含所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的培养基中培养7天，与捕获有所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的抗原提呈细胞共培养3d，培养第8天用加入il-7和il-15培养，培养第13天加入il-2和pha培养，培养第16天收集细胞，灭活细胞，分离抗原特异性cd4+t细胞。
10、优选的，所述培养基以rpim1640为基础培养基，还包括以下含量的组分：体积百分含量的10％fbs、5mm hepes、2mm l-谷氨酰胺、0.05mm巯基乙醇、100u/ml链霉素与青霉素5～10ng/ml的il-15和il-7；
11、所述培养基中，所述自身抗原的浓度为5～50μg/ml。
12、优选的，所述类风湿性关节炎样本来源的脾细胞的浓度为(1～10)×107/ml。
13、优选的，所述捕获自身抗原的抗原提呈细胞的制备方法，将5～50μg/ml类风湿关节炎自身抗原表位多肽溶液与抗原提呈细胞进行共孵育本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种类风湿关节炎自身抗原表位多肽，其特征在于，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端谷氨酰胺替换为D型谷氨酰胺，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端进行乙酰胺化修饰，同时所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的C端进行酰胺修饰。
2.一种抗原特异性T细胞疫苗，其特征在于，类风湿性关节炎样本来源的脾细胞经权利要求1所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽刺激后灭活分离得到。
3.根据权利要求2所述抗原特异性T细胞疫苗，其特征在于，所述抗原特异性T细胞疫苗为灭活的抗原特异CD4+T细胞。
4.权利要求2或3所述抗原特异性T细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述培养基以RPIM1640为基础培养基，还包括以下含量的组分：体积百分含量的10％FBS、5mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、0.05mM巯基乙醇、100U/mL链霉素与青霉素5～10ng/mL的IL-15和IL-7；
6.根据权利要求4所述制
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述捕获自身抗原的抗原提呈细胞的制备方法，将5～50μg/mL类风湿关节炎自身抗原表位多肽溶液与抗原提呈细胞进行共孵育；
8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述IL-7和IL-15的终浓度为5～20ng/mL；
9.根据权利要求4～8任意一项所述制备方法，其特征在于，所述灭活细胞的方法为用20～50μg/mL丝裂霉素处理30min～60min；
10.权利要求1或2所述抗原特异性T细胞疫苗或权利要求3～9任意一项所述制备方法得到的抗原特异性T细胞疫苗在制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种类风湿关节炎自身抗原表位多肽，其特征在于，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的n端谷氨酰胺替换为d型谷氨酰胺，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的n端进行乙酰胺化修饰，同时所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的c端进行酰胺修饰。
2.一种抗原特异性t细胞疫苗，其特征在于，类风湿性关节炎样本来源的脾细胞经权利要求1所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽刺激后灭活分离得到。
3.根据权利要求2所述抗原特异性t细胞疫苗，其特征在于，所述抗原特异性t细胞疫苗为灭活的抗原特异cd4+t细胞。
4.权利要求2或3所述抗原特异性t细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述培养基以rpim1640为基础培养基，还包括以下含量的组分：体积百分含量的10％fbs、5mm hepes、2m...
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