本发明专利技术涉及人促肝再生因子衍生物及其在大肠杆菌中的表达。本发明专利技术通过大肠杆菌原核融合表达系统，获得具有天然活性，不含内毒素，可大规模生产的重组人促肝再生因子衍生物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及人促肝再生因子衍生物及其在大肠杆菌中的表达。
技术介绍
促肝再生因子(augment of liver regeneration，ALR)是一种热稳定性的小分子促肝细胞增殖因子，早在1931年，Higgins和Anderson首先对大鼠70％肝切除后的肝再生进行了经典描述。此后不久，Muiunkin和Breuhans观察到30％-40％肝切除两天的大鼠肝脏组织匀浆物具有显著的促有丝分裂反应活性。二十年后，Teir和Ravanti以及Teir的研究生Blonquist指出肝脏再生增强活动与初断乳大鼠肝脏或肝切除后的再生肝脏组织匀浆的促有丝分裂作用相关联，即意味着腹腔注入的组织匀浆能招致大鼠肝脏的有丝分裂。随后，LaBrecque和Pesch指出促进肝细胞再生增强的先决条件是以含有“肝脏刺激物(hepatic stimulator substans，HSS)的胞液提取物作为增生肝源。1994年，Hagiya等首先从含肝脏刺激物(HSS)的胞液中分离纯化并克隆得到了大鼠ALR cDNA，并通过犬的Eck fistula模型即门腔静脉吻合分流术证实了ALR的促肝细胞增殖作用。杨晓明等通过建立CCl4诱导的体内、外肝损伤模型，选择细胞存活率、LDH释放率为体外实验观察指标；选择肝衰竭动物存活率、中毒性肝炎动物外周血清ALT、LDH水平、DNA合成及组织病理学检查等指标为体内实验观察指标，对重组人ALR抗肝损伤的作用进行了综合评价，结果体外实验发现重组人ALR能提高受损肝细胞的存活率，降低CCl4诱导损伤肝细胞LDH的释放。体内实验发现重组人ALR能提高CCl4诱导肝功能衰竭动物的存活率，促进肝细胞增殖，降低动物外周血ALT、LDH水平，表明ALR不仅是一种重要的肝再生刺激因子，而且在肝损伤修复过程中有重要促进作用。目前，国内广泛应用从新生小牛肝、乳猪肝提取的促肝细胞增殖因子治疗重型病毒性肝炎，并取得较好疗效，但这些制剂受其来源、种源差异及其纯度的限制，应用推广受到较大的限制，而重组人ALR则弥补了以上不足。国内杨晓明等曾采用真核细胞cos-7细胞表达ALR并对其在体外促进HTC肝癌细胞增殖的作用进行了研究，但采用此方法表达的ALR非常微量，根本无法进行大规模制备。随后，国内杨晓明等及易学瑞等分别采用原核细胞大肠杆菌成功表达了ALR，使得其大规模制备得以实现，但是在他们的方法中，ALR在大肠杆菌中是以包涵体形式表达的，其失去了生物活性，需要经过复杂的变复性及纯化工艺，使其恢复生物活性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是通过原核细胞大肠杆菌融合表达系统，获得具有天然活性，可大规模表达的人促肝再生因子衍生物，该衍生物与天然人促肝再生因子具有相同的活性。本专利技术公开的重组人促肝再生因子具有sequence 1的氨基酸序列和sequence 2的DNA序列。经DNA序列测定，与文献报道的hALR序列相比本专利技术重组人促肝再生因子在N端多了两个氨基酸。本专利技术所要解决的另一技术问题是公开上述重组人促肝再生因子的制备方法。本专利技术人促肝再生因子衍生物通过大肠杆菌表达的步骤包括提取胎肝总RNA↓RT-PCR扩增目的片段hALR cDNA↓纯化PCR产物↓克隆目的片段至载体pGEM-T↓重组质粒的筛选和鉴定↓PCR定点突变修复 ↓质粒DNA pGEM-T/hALR cDNA的双酶切↓凝胶回收hALR cDNA片段↓hALR cDNA克隆于原核融合表达载体pGEX-4T-3形成pGEX-4T-3/hALRcDNA↓转化大肠杆菌进行诱导表达↓离心收集菌体↓超声破碎，离心，收集上清液↓亲和层析柱纯化↓收集目的峰，加入凝血酶酶切 酶切液65℃加热，离心，收集上清酶切液经阴离子交换柱纯化↓ ↓阴离子交换柱纯化 凝胶过滤柱纯化↓ ↓凝胶过滤柱交换缓冲液 分装、冻干 体外、体内活性测定本专利技术实施例1中详细提供了人促肝再生因子在大肠杆菌中的表达，该方法通过TRIZOL试剂提取胎肝总RNA，RT-PCR扩增目的片段hALR cDNA，其中采用的引物分别为P1(sequence 3)、P2(sequence 4)。PCR产物经纯化后克隆至载体pGEM-T，获取质粒PGEM-T/hALR，突变修复后的质粒进行BamHI、EcoR I双酶切，得重组质粒pGEX-4T-3/hALR，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)或DH5α，筛选重组子，诱导表达，离心收集菌体，超声破碎、上清液经亲和层析纯化、酶切，精纯化后获得产物。采用大肠杆菌原核融合表达系统获得的人促肝再生因子为可溶形式，保持天然活性，同时采用亲和层析纯化，使操作简单成本降低，提高回收率。附图说明图1 实施例1PCR定点突变技术路线图2 实施例1重组质粒pGEX-4T-3/hALR cDNA的构建图具体实施例方式实施例1、人促肝再生因子在大肠杆菌中的表达一、人促肝再生因子cDNA的克隆菌种DH5α，质粒pGEM-T主要技术路线提取胎肝总RNA↓RT-PCR扩增目的片段hALR cDNA↓纯化PCR产物↓克隆目的片段至载体pGEM-T↓重组质粒的筛选和鉴定1、TRIZOL试剂提取胎肝总RNA称取新鲜胎肝组织50mg，充分剪碎，转至匀浆管中加入1.2mlTRIZOL试剂↓电动匀浆约2min，匀浆液转移至1.5ml离心管↓25℃孵育5min加入0.2ml氯仿，振摇15秒↓25℃孵育2-3min 2-8℃离心15min，转速11000rpm↓小心吸取上层水相↓取200μl加入200μl异丙醇↓15-30℃孵育10min12000g离心15min↓弃上清加0.6ml75％乙醇洗涤↓7500g离心5min↓弃上清37℃保温30min挥发残留乙醇后，100μl DEPC水溶解↓RNA甲醛琼脂糖电泳及紫外分光光度定量2.RT-PCR扩增目的片段hALR cDNA取2μg总RNA和0.5μg Oligo(dT)12-18溶于12μl焦碳酸二乙酯处理的水中，70℃温育10min后置于冰浴，加入10×PCR缓冲液2μl，25mmol/L MgCl22μl，10mmol/L dNTP混合物1μl，0.1mol/L DTT2μl，短暂离心后42℃温育5min。加入1μl SuperScrit RT(200U)，42℃温育50min，70℃15min灭活酶活性，最后加入1μl(2U)RNaseH，37℃温育20min，以降解未转录的RNA。取上述制备的逆转录反应液2μl，加入引物P1、P2(序列见sequence number 3、4)各2μl，10×PCR缓冲液10μl，25mM MgCl26μl，10mM dNTP混合液2μl，ddH2O 75μl，94℃变性后加入taq酶1μl，，然后进行PCR扩增94℃45秒，56℃1min，72℃1min，共35个循环。最后一次循环72℃延伸10min。3.PCR产物的克隆及重组转化子的鉴定PCR产物经琼脂糖电泳、割胶纯化后，取PCR产物6μl(约1μg)，加入10×PCR缓冲液2μl，载体pGEM-T 3μl(约0.5μg)，T4DNA连接酶2μl(10U)，ddH2O 7μl，混匀，短暂离心，14℃水浴放置9hr。按氯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人促肝再生因子衍生物，其特征在于该人促肝再生因子衍生物具有下述氨基酸序列：Ｇｌｙ ＳｅｒＭｅｔＡｒｇＴｈｒＧｌｎＧｌｎＬｙｓＡｒｇＡｓｐＴｈｒ ＬｙｓＰｈｅＡｒｇＧｌｕ Ａｓｐ１５１０１５ＣｙｓＰｒｏＰｒｏＡｓｐＡｒｇＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｙＡｒｇＨｉｓＳｅｒＴｒｐＡｌａＶａｌＬｅｕ２０２５３０Ｈ ｉｓＴｈｒＬｅｕＡｌａＡｌａＴｙｒＴｙｒＰｒｏＡｓｐＬｅｕＰｒｏＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｎＧｌｎ３５４０４５ＧｌｎＡｓｐＭｅｔＡｌａＧｌｎ ＰｈｅＩｌｅＨｉｓＬｅｕＰｈｅＳｅｒＬｙｓＰｈｅＴｙｒＰｒｏＣｙｓ５０５５６０ ＧｌｕＧｌｕＣｙｓＡｌａＧｌｕＡｓｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＡｒｇ ＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｓｎＨｉｓＰｒｏ６５７０７５８０ＡｓｐＴｈｒＡｒｇＴｈｒＡｒｇＡｌａＣｙｓＰｈｅＴｈｒＧｌｎＴｒｐＬｅｕＣｙｓＨｉｓ ＬｅｕＨｉｓ８５９０９５ＡｓｎＧｌｕＶａｌＡｓｎＡｒｇＬｙｓＬｅｕＧｌｙＬｙｓＰｒｏＡｓｐＰｈｅＡｓｐ ＣｙｓＳｅｒＬｙｓ１００１０５１ １０ＶａｌＡｓｐＧｌｕＡｒｇ ＴｒｐＡｒｇＡｓｐＧｌｙＴｒｐＬｙｓＡｓｐＧｌｙＳｅｒＣｙｓＡｓｐ１１５１２０１２５其具有下述ＤＮＡ序列：ｇｇａｔ ｃｃａｔｇｃｇｇａｃｇｃａｇｃａｇａａｇｃｇｇｇａｃａｃｃａａｇｔｔｔａｇｇｇａｇｇａｃｔｇ ｃｃｃｇｃｃｇｇａｔ６０ｃｇｃｇａｇｇａａｃｔｇｇｇｃｃｇｃｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｃ ａｃｃｃｔｇｇｃｃｇｃｃｔａｃｔａｃｃｃｃ１２０ｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃｃａｇａａｃａｇｃａｇｃａａｇａｃａｔｇｇｃｃｃａｇ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡在龙，毛积芳，贺雪峰，陈车生，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，上海唯科生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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