GDF15受体下游信号因子的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及GDF15受体下游信号因子的鉴定方法。本发明专利技术人首次应用HSP90共转化的方式重组表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区，应用His标签进行蛋白纯化，FLAG标签和钙调素结合蛋白标签捕捉生长分化因子15以及与其相互作用的蛋白的复合体。该复合体可运用于对GDF15受体的下游信号因子进行鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程和分子生物学领域。更具体而言，本专利技术涉及⑶F15受体下 游信号因子的鉴定及应用。
技术介绍
生长分化因子15 (⑶F15)是转化生长因子β (TGF- β )超家族的一员，具有典型的 TGF-β超家族蛋白结构特点。GDF15在胚胎的生长发育，细胞对压力信号的反应，炎症和组 织损伤后修复的过程中均起着重要作用。TGF-β是一个多功能细胞因子，可以影响多种细 胞的生长、分化及凋亡。在免疫系统中，TGF-β能够诱导Foxp3在⑶4+⑶25-Τ细胞中的表 达，使前〗、6 1'细胞分化为丨!^68。〇^15基因的661^&1^登录号为：匪_004864.2，蛋白的 GenBank 登录号为：NP_004855. 2。 GDF15在静态细胞中的表达量往往比较低，但是许多细胞压力信号都可以使 GDF15的表达量突然提高，例如在炎症、病毒感染、急性组织损伤等情况下或在肿瘤恶化过 程中。许多信号通路都与GDF15的表达、分泌及其在细胞基质中的储存的调节有关，并调节 ⑶F15的功能。⑶F15的表达受P53、Spl、Sp3、Nkx-2、NF-κ B、AP-I等多个转录因子的调 控，P53对GDF15的调控作用与其在抑制肿瘤转移和促进凋亡方面密切相关。GDF15的启动 子区具有两个P53的结合位点，其启动子激活具有显著的P53浓度依赖性和P53转录结合 位点依赖性。在人卵巢癌和前列腺癌细胞中，GDF15作为P53的下游因子被诱导表达，可以 降低癌细胞的转移。此外，许多其它转录因子也能诱导GDF15在一定类型的细胞中表达，例 如在乳腺癌细胞中，Akt的激活能够上调GDF15的表达。在黑色素细胞中，紫外线照射能够 明显上调⑶F-15的mRNA水平，而在黑色素瘤细胞系中，通过激活MAPK和MITF也能够明显 上调0^-15的1^隱水平。 ⑶F15通过自分泌和旁分泌的作用发挥抗炎症反应、抑制生长、促进肿瘤细胞凋亡 等功能。作为TGF-β超家族的一员，GDF15可通过依赖或非依赖Smad的方式传导信号，也 可通过激活其它的信号元件来发挥功能，如PI3K/Akt、FAK-RhoA、Ras/MAPKs等。虽然⑶F15 的受体还没有被鉴定出来，但是作为TGF-β超家族的一员，在某些细胞中GDF15能够通过 激活TGF-β的I型和II型受体及细胞内的Smad蛋白复合物来介导细胞的反应。Yi Sun 等证明GDF15蛋白或转染的GDF15能够抑制前列腺癌细胞系的生长，该过程的信号通路与 TGF-β的相似，⑶F15能够对存在完整TGF-β信号通路的癌细胞系的生长起到抑制作用， 但是不能对TGF- β I型和II型受体突变细胞或SmacM失活细胞起到抑制作用。GDF15在培 养的新生儿心肌细胞中的表达能够通过激活Smad2/3的信号通路起到诱导抗心肌肥厚反 应，通过过表达Smad6/7可以消除⑶F15的此种作用。在肝癌细胞中，⑶F15通过Akt及其 下游信号通路的磷酸化来介导其功能。SK Batra等证明在前列腺癌细胞中，⑶F15能够通 过激活FAK-RhoA信号通路，介导肌动蛋白的调整，从而影响癌细胞的迁移。在乳腺癌细胞 中，目前已知⑶F15能够激活ErbB家族受体酪氨酸激酶，并能够通过反式激活ErbB2而激 活Erkl/2和Akt，从而激活乳腺癌细胞的侵袭潜能。 综上所述，GDF15在多种癌症的发生发展过程发挥着重要的作用，在癌症发生发展 的不同阶段均发挥着重要的作用，但由于其精确受体目前尚未鉴定，所以在分子机制上研 究GDF15如何发挥其多样性功能至关重要，这将为基础分子免疫研究转化为临床研究，以 及多种癌症如乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种癌症的治疗提供新的药物靶点。此外，Treg细 胞在癌症的发生发展及逃逸过程中均发挥着重要的功能，而TGF- β对调节性T细胞的分化 及功能发挥有着重要的作用。 因此，了解作为TGF-β家族的⑶F15蛋白对调节性T细胞作用将有利于进一步研 究GDF15在不同的癌症发展过程通过调节免疫系统发挥的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供⑶F15受体下游信号因子的鉴定及应用。 在本专利技术的第一方面，提供一种制备生长分化因子15(⑶F15)胞外区的方法，所 述方法包括： (1)提供一表达构建物，其从5'至3'端依次包括以下操作性连接的元件：His标 签序列，FLAG标签序列，TEV蛋白酶体识别序列，钙调素结合蛋白（CBP)的基因序列，生长分 化因子15胞外区序列； ⑵将步骤（1)的表达构建物与HSP90蛋白的表达构建物共转大肠杆菌（如 Rosetta)细胞，表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区（较佳地，包括二聚体形 式的结构）。 在一个优选例中，步骤（2)之后，还包括分离纯化所述带有TAP标签的生长分化因 子15胞外区的步骤。 在本专利技术的另一方面，提供一种表达构建物，其从5'至3'端依次包括以下操作性 连接的元件：His标签序列，FLAG标签序列，TEV蛋白酶体识别序列、钙调素结合蛋白（CBP) 的基因序列，生长分化因子15胞外区序列。 在一个优选例中，所述的表达构建物是表达载体。 在本专利技术的另一方面，提供所述的表达构建物的用途，用于表达带有TAP标签的 生长分化因子15胞外区，捕获与生长分化因子15相互作用的蛋白。 在本专利技术的另一方面，提供一种捕获与生长分化因子15相互作用的蛋白的方法， 所述方法包括： (a)利用所述的表达构建物表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区； (b)利用His标签，镍柱纯化获得纯化中间物1 ; (c)利用Flag抗体，对步骤（b)的产物进一步纯化（如用Protein A/G beads纯 化），获得纯化中间物2 ; (d)利用TEV酶酶切纯化中间物2,获得纯化中间产物3 ; (e)利用钙调素从中间产物3中捕捉获得终产物，该终产物包括与生长分化因子 15相互作用的蛋白。 在一个优选例中，步骤（c)中，以附着有抗Flag抗体的Protein A/G的固相载体 (较佳地为珠（beads))与Flag结合，进行纯化。 在一个优选例中，步骤（e)中，以附着有钙调素的固相载体（较佳地为珠（beads)) 与钙调素结合蛋白结合，进行捕捉。 在一个优选例中，步骤（e)后，还包括： 步骤（f):将捕捉出的复合物质谱鉴定，分析出与生长分化因子15相互作用的蛋 白；和/或 步骤（g):通过抑制剂实验和/或基因沉默（knock down)实验确定与生长分化因 子15相互作用的蛋白对于生长分化因子15信号通路的影响。 在本专利技术的另一方面，提供一种蛋白复合物，所述的复合物包括：生长分化因子 15胞外区以及与之结合的下游蛋白，所述的下游蛋白包括：GNAI1，GNB1，MMl，CAMKII， MERTK0 在本专利技术的另一方面，提供生长分化因子15(⑶F15)胞外区的用途，用于体外诱 导naive T细胞分化表达Foxp3为iTreg细胞。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。【附图说明】 图1A-1C、体外纯化出带有亲和纯化标签的有活性的TAP-tag-ex⑶F15蛋白。 图1A、融合表达His标签、FLAG标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备生长分化因子15胞外区的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供一表达构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件：His标签序列，FLAG标签序列，TEV蛋白酶体识别序列，钙调素结合蛋白的基因序列，生长分化因子15胞外区序列；(2)将步骤(1)的表达构建物与HSP90蛋白的表达构建物共转大肠杆菌细胞，表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，殷淑英，林芳，李孔晨，李丹，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31