松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列及其克隆方法，涉及生物基因工程领域。所述克隆方法：提取松墨天牛成虫总RNA，采取RACE扩增获得基因3′端序列，与构建的cDNA文库松墨天牛核受体共激活因子7基因5′端序列拼接获得基因全长序列。该基因序列全长3345bp，基因开放阅读框为1‑2970bp，共编码989个氨基酸。本发明专利技术补充了松墨天牛核受体共激活因子类的基因，对研究松墨天牛细胞的调控机理及预防松材线虫萎蔫病的传播提供了有利支持。本发明专利技术由国家自然科学基金(31470653)和广东省自然科学基金(1414050001666)支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程领域，具体是涉及松墨天牛核受体共激活因子7基因序列及其克隆方法。该基因编码核受体共激活因子7，该因子属于雌激素受体蛋白，可以保护细胞DNA氧化损伤。技术背景核受体共激活因子7(nuclear receptor coactivator 7，NCOA7)，属于雌激素受体蛋白，可以保护细胞DNA氧化损伤。核受体是生物体内含量最丰富的几大类转录因子超家族之一，机体的生长发育、细胞分化，以及体内许多生理、代谢过程都可归因于核受体与相应配体及众多共调节因子相互作用所调控的基因网络的协调表达。松墨天牛(Monochamus alternatus)，主要危害马尾松、黑松、油松等针叶树的树干和枝条的韧皮部和木质部，同时也是松材线虫萎蔫病的主要传播媒介。目前对于对于松墨天牛核受体共激活因子7基因及其对松墨天牛细胞的调控机理尚无人研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供松松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列及其克隆方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：1、总RNA的提取对松墨天牛成虫活体样品用液氮急冻处理，置于-80℃备用。采用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II总RNA提取试剂盒提取松墨天牛成虫总RNA。2、引物设计和3′RACE扩增根据本实验构建的cDNA文库中所获得的松墨天牛核受体共激活因子7的5′端序列，本专利技术在此基础上进行3′RACE扩增，以获得松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列。3′RACE扩增的特异性引物为：Ma-NCOA7-3′-Outer：GGAAATGGACACAGAGCMa-NCOA7-3′-Inner：TCTTCAGCACCAGCCAG3、目的基因克隆及测序套式PCR产物经由1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的DNA片段，与pMD20-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，进行AMP抗性蓝白斑筛选，挑选阳性菌落经菌落PCR鉴定后测序。4、序列拼接将测序结果正确的序列与构建的cDNA文库松墨天牛核受体共激活因子7基因5′端序列拼接，获得松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列。松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列，该序列如下：序列中下划线所标示的atg为初始密码子，下划线所标示的taa为终止密码子。根据松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列，得到其氨基酸序列。该序列如下：本专利技术利用基因克隆技术，对松墨天牛成虫进行RNA提取，并以3′RACE技术扩增松墨天牛核受体共激活因子7基因片段，在感受态细胞上进行目的基因克隆并测序，将测序结果正确的序列与构建的cDNA文库松墨天牛核受体共激活因子7基因5′端序列拼接，获得松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列。对进一步研究松墨天牛细胞的调控机理以及预防松材线虫萎蔫病的传播提供了有利支持。具体实施方式以下实施例将本专利技术进一步说明。1、松墨天牛总RNA提取松墨天牛成虫采自广州市从化马尾松林。新鲜活虫用液氮急冻后保存于50mL冻虫管中，置于-80℃冰箱内保存备用。采用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II总RNA提取试剂盒提取松墨天牛成虫总RNA，具体方法如下：1)在经液氮充分预冷的研钵中研磨样品至粉末状，取不多于0.1g样品粉末放入经液氮充分预冷的1.5mL离心管中，待液氮完全蒸发完后，加入1mL RNA-Solv Reagent。2)将加入裂解液的样品室温放置2-3min，使得样品完全裂解。3)加入200μL氯仿，涡旋15s，冰上孵化10min；4℃下12000rcf离心15min，出现上层水相。4)转移600μL上层水相至新的1.5mL离心管，加入200μL无水乙醇，剧烈震荡15s，转移全部混合液到试剂盒提供的2mL Collecting tube，室温下10000rcf离心1min。5)将收集管中液体再次转移至吸附柱中，室温下10000rcf离心1min。6)将吸附柱放入新的2mL Collecting tube，加入300μL RNA wash Bufferl，室温下10000rcf离心1min，弃废液。7)将吸附柱放回收集管中，加入400μL RNA wash Bufferl，室温下10000rcf离心1min，弃废液。8)将吸附柱放回收集管中，加入500μL经添加48mL无水乙醇稀释的RNA wash Buffer2，室温下10000rcf离心1min，弃废液。9)重复上一步骤。10)再次室温下13000rcf离心2min。11)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央悬空滴加40μL DEPC Water，室温静置2min，室温下13000rcf离心1min，将所得的RNA溶液置于-80℃冰箱保存。注意事项：用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌(180℃，60min)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用0.1％的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验使用的试剂盒无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。2、cDNA 3′末端扩增按照3′Full RACE Core Set Ver.2.0 kit试剂盒进行，具体操作步骤如下：1)反转录反应反应体系如下：PCR反应程序为：42℃反应60min，70℃反应15min。2)套式PCR扩增a)Outer PCR扩增反应体系如下：PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，20个循环，然后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。b)Inner PCR扩增反应体系如下：PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，然后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。3、目的基因克隆及测序1)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段a)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，室温下，12000rcf离心1min，弃废液。b)将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶切下(尽量切除多余部分)放入干净的1.5mL离心管中，称取重量。c)向胶块中加入等倍体积溶液PC(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PC溶液)，50℃水浴10min左右，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。d)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，12000rcf离心1min，弃废液。e)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW(使用前先加入60mL无水乙醇稀释)，静置3-4min，12000rcf离心1min，弃废液。f)重复上一步骤。g)再次12000rcf离心2min，尽量除去漂洗液。室温放置3min，彻底晾干。h)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间悬空滴加40μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rcf离心2min。i)将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12000rcf离心2min，收集DNA溶液到200μL PCR管中，置于-20℃冰箱保存备用。2)T载体连接PCR管中依次加入：pMD20-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列，其特征在于该序列由3345个碱基对组成，此全长序列为：序列中下划线标示的atg为初始密码子，下划线标示的taa为终止密码子，所获得的松墨天牛核受体共激活因子7cDNA全长序列的编码区从第1个核苷酸到2970个核苷酸。
【技术特征摘要】
1.一个松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列，其特征在于该序列由3345个碱基对组成，此全长序列为：序列中下划线标示的atg为初始密码子，下划线标示的taa为终止密码子，所获得的松墨天牛核受体共激活因子7cDNA全长序列的编码区从第1个核苷酸到2970个核苷酸。2.根据权利要求所述的松墨天牛核受体共激活因子7基因核苷酸序列，其表达的蛋白为核受体共激活因子7，其特征在于，松墨天牛核受体共激活因子7由989个氨基酸组成，其氨基酸序列为：3.如权利要求1所述松墨天牛核受体共激活因子7基因全长序列的克隆方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：林同，刘琪司，陈敬祥，吴华俊，蔡紫玲，程杰，黄卫东，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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