一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器及其构建方法和应用，属于生物制品的微生物制造领域。本发明专利技术构建了含有EGF和Ble双基因的载体pSP108‑EGF，并通过玻璃珠搅拌法进行莱茵衣藻的转化，成功获得经PCR和Southern Blot双重筛选确定的EGF‑Ble阳性转化子，衣藻转化子的EGF含量采用人EGF的ELISA试剂盒进行检测。采用本发明专利技术的方法制备EGF，可以克服现有技术以细菌生产EGF时产物的活性低、纯化过程复杂等缺点，更安全、有效，并具有成本低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器及其构建方法和应用。
技术介绍
莱茵衣藻的细胞核转化技术衣藻是一种单细胞真核绿藻，因其培养条件简单、生长周期短、生长迅速、光合效率高而素有“光合酵母”之称,衣藻已完成基因组测序,序列结构比较清楚，是目前少数三套基因组(细胞核、叶绿体和线粒体)都能进行遗传转化的生物，其生物学特性为在短时间内获得大量遗传稳定的转基因后代，并进一步作为生物反应器提供了便利条件。将衣藻开发为生物反应器，生产各种活性蛋白质制品有以下潜在优势：一.作为光合自养微生物，生产成本低廉,经济划算；二.衣藻作为真核生物,具有复杂的翻译后修饰系统，可以对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰，使得重组表达的蛋白具有天然蛋白同等活性；三.衣藻本身不带有对人体有害的物质,如内毒素、免疫敏感蛋白等；四.衣藻反应器不产生有毒废弃物，培养、收集、提取过程简单，副产品无环境污染风险。现在已建立成熟的衣藻核转化技术，其技术有外源基因的转化技术(如电转化，玻璃珠转化，基因枪法，多聚物介导法)、衣藻转化的筛选基因研究(如內源筛选标记基因ARG7、NIT1、OEE1以及外源筛选标记基ble，hpt等)，在莱茵衣藻中成功表达的外源基因包括ble、aphVIII、hpt、金黄色葡萄球菌肠毒素C2，串联抗菌肽基因和phbB基因等。虽然衣藻的转化体系已经建立，但都是显著的在研究单个标记基因的表达模式，寻求更加快速、严谨、稳定的阳性子筛查方式，这是由于转化体系中携带标记基因和外源基因的双元基因载体的构造模式未能理论突破，也没有建立成熟的双元/多元转化模型，已报道的双元表达载体都是采用单个表达式简单的重复叠加形成，案例产生的衣藻转化子不稳定，难以成为生物反应器。EGF的表达技术表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)是机体细胞合成和分泌的小分子多肽类物质，由53个氨基酸组成。研究表明，EGF对机体不同细胞具有促生长作用，参与各种细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程，其中最大特点在于EGF可刺激表皮细胞、内皮细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。EGF临床上可促进受损表皮的修复与再生，在治疗消化道溃疡、角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合方面均取得了显著的疗效。同时由于EGF是一种人体产生的生物因子，故没有任何毒副作用，使用中未造成生物安全隐患，这使得EGF在化妆品领域中得到了广泛应用，可以起到延缓皮肤细胞衰老,使皮肤滋润光滑的作用，相比于一些其它的抗皱方法，安全是EGF卓越的优点。天然的EGF一般来自于动物体组织提取，但来源有限、成本较高、工艺复杂且产量甚微，远不能满足临床应用的需要，而采用基因工程方法生产EGF有望降低生产成本，增加产量，目前人表皮生长因子售价约为每克纯品30万港币，由于其生产具有巨大的经济效益和应用前景，很多企业和研究机构都在致力于EGF的基因工程产品研究和开发。EGF基因已在几种宿主系统中得到克隆、表达与分泌，包括大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、蓝藻(cyanobacterium)等，由于表达系统之间特性各异，因此表达效果也有所不同。由于EGF基因是一个真核基因，早期的研究均在真核细胞中表达EGF，得到具有生物活性的EGF，如酵母、蓝藻表达系统。但由于技术以及纯化条件等的限制，即使真核表达系统能够获得有活性的EGF蛋白，这些表达案例中普遍存在表达量不高、融合表达-纯化繁琐等缺陷,难以应用于产业化生产。原核表达系统的遗传背景清楚，易于改造，工艺简单，成本低，流程短，蛋白表达水平高易于纯化，也是表达EGF基因的合适选择，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表达系统。但由于在大肠杆菌中表达的EGF蛋白以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物，需要用变性剂处理，在适当条件下使其复性才能具有天然结构，限制了EGF的工业化生产及其应用。为解决以上问题,目前在大肠杆菌中采用融合蛋白表达的方法，如与谷胱甘肽硫转移酶(GST)、金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)、天蚕素B等融合表达以期提高EGF的表达量和可溶度，但是，所获得的蛋白产物需要经过去标签，再折叠，多次纯化等处理过程，最终造成EGF比活的降低，未能改善EGF的生产现状。根据现有研究，通过原核或真核系统表达EGF均存在表达量不高、活性低、纯化工艺复杂等缺陷。这不仅制约了EGF的临床研究和临床应用，也限制了EGF化妆品在消费人群中的进一步推广。因此，开发一种高效的EGF生产工艺不仅具有巨大的经济价值，也为EGF研究开发出更广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对现有技术生产EGF存在的问题，研究并获得了一种可以用于生产EGF的衣藻生物反应器。具体而言，本专利技术的
技术实现思路
包括以下几个方面：本专利技术的专利技术人首先提供了一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器，所述衣藻为莱茵衣藻，所述衣藻具有编码人表皮生长因子的核苷酸序列。具有EGF基因的阳性子衣藻能够生产具有活性的EGF蛋白，并且克服了大肠杆菌生产EGF活性低、纯化过程复杂和安全性低的缺点。本专利技术实施例采用的莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)为美国杜克大学提供的莱茵衣藻细胞壁缺陷型菌株CC400。全文所述的“衣藻”和“莱茵衣藻”均代表莱茵衣藻。本专利技术所述的人表皮生长因子的衣藻生物反应器，其具有的编码人表皮生长因子的核苷酸序列。优选衣藻生物反应器具有的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器的构建方法，所述方法包括以下步骤：1)以人EGF基因序列为基础，按照衣藻密码子偏好情况设计三对引物，PCR扩增获取EGF扩增产物，扩增产物连接pMD19-T载体得到pMD19-T-EGF；2)用含有启动子Rbcpro、终止子Rbcterm和基因ble的质粒pSP108与步骤1)的pMD19-T-EGF构造Rbcpro-EGF-Rbcterm的EGF表达载体pEGF；3)构造筛选标记基因Ble-EGF基因双元表达式载体：用pUC载体作为基础，将抗性基因Ble表达结构与EGF表达结构串联连接，形成融合表达式，设置单酶切位点于两侧，构造EGF的衣藻双元表达载体pSP108-EGF；4)双元表达载体pSP108-EGF采用玻璃珠转化法转化衣藻，尝试线性化和环状载体的转化，筛选并获得阳性子。本专利技术的专利技术人通过统计衣藻中成功转化使用的标记基因密码子使用情况，按照衣藻的密码子偏好性设计了三对引物EGF1/EGF2，EGF3/EGF4，以及EGF-sense-MscI/EGF-anti-XbaI，它们的序列分别为EGF1/EGF2：ATGGCGAACTCCGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTACTGCCTGCACGAC/GTACTTGTCCAGCGCTTCGATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器，所述衣藻为莱茵衣藻，其特征在于，所述衣藻具有编码人表皮生长因子的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器，所述衣藻为莱茵衣藻，其特征在于，所述衣藻具有编码人表皮生长因子的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1或2所述的一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器的构建方法，包括以下步骤：1)以人EGF基因序列为基础，按照衣藻密码子偏好情况设计三对引物，PCR扩增获取EGF扩增产物，扩增产物连接pMD19-T载体得到pMD19-T-EGF；2)用含有启动子Rbcpro、终止子Rbcterm和基因ble的质粒pSP108与步骤1)的pMD19-T-EGF构造Rbcpro-EGF-Rbcterm的EGF表达载体pEGF；3)构造筛选标记基因Ble-EGF基因双元表达式载体：用pUC载体作为基础，将抗性基因Ble表达结构与EGF表达结构串联连接，形成融合表达式，设置单酶切位点于两侧，构造EGF的衣藻双元表达载体pSP108-EGF；4)双元表达载体pSP108-EGF采用玻璃珠转化法转化衣藻，采用环状载体的转化，筛选并获得阳性子。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述三对引物为EGF1/EGF2，EGF3/EGF4，EGF-sense-MscI/EGF-anti-XbaI，其序列分别如序列表SEQIDNO.2～SEQIDNO.7所示。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述PCR扩增方法为：混合所有引物，以Ex-Taq进行PCR扩增，PCR程序为94℃，30秒，2个循环；40℃30秒，72℃30秒；94℃30秒，40℃30秒，72℃30秒，25个循环，获得的扩增产物。6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述EGF表达载体pEGF的构造方法为：将含有启动子Rbcpro、终止子Rbcterm和基因ble的质粒pSP108和pMD19-T-E...

【专利技术属性】
技术研发人员：王川，
申请(专利权)人：四川理工学院，
类型：发明
国别省市：四川,51