一种重组自分泌运动因子的表达方法技术

一种重组自分泌运动因子的表达方法，目的是保持较高活性，高水平表达均一性糖基化修饰；本发明专利技术通过构建pInsulator4x‑ATX β‑8His‑DHFR重组表达载体，利用CAG启动子和双顺反子IRES共表达ATX和DHFR基因，引入绝缘子insulator（4X）避免了基因之间的相互影响，通过MTX阶梯式梯度加压筛选大大增加了ATX在HEK293宿主细胞中的重组表达水平；通过控制重组细胞株的接种量、补料方式、培养温度和转速、谷氨酰胺和葡萄糖含量监测及pH值控制，使重组蛋白获得了较为均一性的糖基化修饰，最终ATX蛋白获得12 mg/L的高收率，且保持较高的lysoPLD和PDE活性。

【技术实现步骤摘要】
一种重组自分泌运动因子的表达方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高活性自分泌运动因子(autotaxin,ATX)的高水平表达方法。
技术介绍
自分泌运动因子ATX是一种最初自黑素瘤细胞上清液中作为自分泌运动性刺激因子而分离获得的分泌型糖蛋白(StrackeML,KrutzschHC,UnsworthEJ,etal.Identification,purification,andpartialsequenceanalysisofautotaxin,anovelmotility-stimulatingprotein.JBiolChem,1992,267(4):2524-2529)。ATX属于外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员(ectonucleotidepyrophos-phatases,ENPPs)，因此又称为ENPP2，具有磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)活性，同时又是ENPPs家族中唯一具有溶血磷脂酶D(lysophospholipaseD,lysoPLD)活性的成员。ATX独特的lysoPLD活性是其发挥重要生物学功能的基础，它可以将溶血磷脂胆(lysophosphatidyl-choline,LPC)水解成溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid,LPA)。而LPA作为细胞内外信号转导最重要的核心脂质信号分子，通过结合特异性G蛋白偶联受体影响细胞增殖、分化、迁移和凋亡，参与多种生理和病理过程，特别是与肿瘤的生存、转移和侵入关系密切。因此ATX作为LPA生成最主要的磷脂酶，成为介导靶向抑制LPA生物合成从而防治肿瘤疾病的重要靶点。ATX基因位于人类8号染色体长臂，包含27个外显子，经选择性剪切产生α(915aa)、β(863aa)、γ(888aa)、δ(859aa)、ε(911aa)五种不同蛋白亚型(GigantiA,RodriguezM,FouldB,etal.Murineandhumanautotaxinalpha,beta,andgammaisoforms:geneorganization,tissuedistribution,andbiochemicalcharacterization.JBiolChem,2008,283(12):7776-7789；HashimotoT,OkudairaS,IgarashiK,etal.Identificationandbiochemicalcharacterizationofanovelautotaxinisoform,ATXδ,withafour-aminoaciddeletion.JBiochem,2012,151(1):89-97；TokuharaY,KuranoM,ShimamotoS,etal.ANewEnzymeImmunoassayfortheQuantitativeDeterminationofClassicalAutotaxins(ATXα,ATXβ,andATXγ)andNovelAutotaxins(ATXδandATXε),PLoSOne，2015,10(6):e0130074)。其中ATXβ最初是从畸形癌细胞系克隆获得，含有863个氨基酸，是最短也是最主要的ATX亚型。ATX分子量约为125kDa，具有一个N-端疏水结构域、两个类生长素B结构域、一个催化结构区域和一个核酸酶样结构域。在翻译过程中，ATX首先以蛋白酶原前体形式合成，随后经N端信号肽切除以及弗林蛋白酶(furin)加工，最后通过经典的内质网-高尔基体途径完成糖基化修饰后，以活化糖蛋白形式分泌至细胞外间隙中。ATX在N53、N410、N524三个位点发生的N-糖基化修饰、特别是N524位点的糖基化是ATX活性所必须(JansenS,CallewaertN,DewerteI,etal.Anessentialoligomannosidicglycanchaininthecatalyticdomainofautotaxin,asecretedlysophospholipase-D.JBiolChem,2007,282(15):11084-11091)。LPA受体繁多，信号途径复杂，通过抑制ATX酶活性达到抑制ATX-LPA功能轴信号通路是肿瘤等相关疾病治疗的有效策略。其中基于ATX空间结构解析是其抑制剂筛选最为直接的手段之一。大量制备具有天然蛋白活性和构象的重组ATX蛋白，是其晶体形成和解析的前提。目前大鼠的ATX蛋白晶体结构已于2011年被日本和荷兰、美国科学家所解析(HausmannJ,KamtekarS,ChristodoulouE,etal.Structuralbasisofsubstratediscriminationandintegrinbindingbyautotaxin.NatStructMolBiol,2011,18(2):198-204;DayJE,HallT,PeggLE,etal.CrystallizationandpreliminaryX-raydiffractionanalysisofratautotaxin.ActaCrystallogrSectFStructBiolCrystCommun.2010,66(Pt9):1127-1129)。然而人ATX蛋白晶体解析工作因无法获得大量近似于天然状态的重组蛋白而至今无法完成。关于人ATX蛋白的重组表达研究工作已多有报道，包括大肠杆菌原核重组表达(HagaA,HashimotoK,TanakaN,etal.Scalablepurificationandcharacterizationoftheextracellulardomainofhumanautotaxinfromprokaryoticcells.ProteinExprPurif,2008,59(1):9-17)，杆状病毒表达(GigantiA1,RodriguezM,FouldB,etal.Murineandhumanautotaxinalpha,beta,andgammaisoforms:geneorganization,tissuedistribution,andbiochemicalcharacterization.JBiolChem,2008,283(12):7776-7789.)以及BSC-1、COS-7、HEK293等哺乳动物表达(KawagoeH,StrackeML,NakamuraH,etal.ExpressionandtranscriptionalregulationofthePD-Ialpha/autotaxingeneinneuroblastoma.CancerRes,1997,57(12):2516-21;GigantiA1,RodriguezM,FouldB,etal.Murineandhumanautotaxinalpha,beta,andgammaisoforms:geneorganization,tissuedistribution,andbiochemicalcharacterization.JBiolChem,2008,283(12):7776-7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是：（1）构建pInsulator4X‑IRES‑DHFR质粒构建一种新的哺乳动物表达载体pInsulator4X‑IRES‑DHFR；该载体以商品化pCAGGS哺乳动物表达载体为基本单元，由CAG启动子(CMV early enhancerichken beta actin promoter, 由AG promoter 和hCMV‑IE ehhancer组成)启动，引入内部核糖体进入位点(IRES)连接多克隆酶切位点和二氢叶酸(DHFR)重组核酸来共表达外源基因和DHFR基因，表达元件下游插入CN 104293737.A中的绝缘子insulator（4X）重组核酸；绝缘子insulator单元重组核酸序列为SEQ ID NO:1；（2）构建pInsulator4x‑ATX β‑8His‑DHFR表达载体从人的畸胎癌细胞中利用Trizol试剂盒提取总RNA，利用逆转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA；以cDNA为模版，特异性引物hATX‑For：5’‑GTCAGCGGCCGCCACCATGGCAAGGAGGAGCTC‑3’ （含

【技术特征摘要】
1.一种重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是：（1）构建pInsulator4X-IRES-DHFR质粒构建一种新的哺乳动物表达载体pInsulator4X-IRES-DHFR；该载体以商品化pCAGGS哺乳动物表达载体为基本单元，由CAG启动子(CMVearlyenhancerichkenbetaactinpromoter,由AGpromoter和hCMV-IEehhancer组成)启动，引入内部核糖体进入位点(IRES)连接多克隆酶切位点和二氢叶酸(DHFR)重组核酸来共表达外源基因和DHFR基因，表达元件下游插入CN104293737.A中的绝缘子insulator（4X）重组核酸；绝缘子insulator单元重组核酸序列为SEQIDNO:1；（2）构建pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR表达载体从人的畸胎癌细胞中利用Trizol试剂盒提取总RNA，利用逆转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA；以cDNA为模版，特异性引物hATX-For：5’-GTCAGCGGCCGCCACCATGGCAAGGAGGAGCTC-3’（含NotI酶切位点）、hATX-Rev：5’-GGCCCAATTGTTAGTGGTGATGGTGATGGTGATGATGGGCGCTGCCAATCTCGCTCTCATATGTATG-3’（含MunI酶切位点，C端引入8Histag），扩增ATXβ基因；PCR扩增产物和pInsulator4X-IRES-DHFR质粒经NotI和MunI双酶切，T4DNA连接酶连接后转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌，提取重组质粒pinsulator4X-ATXβ-8His-DHFR，NotI和MunI双酶切鉴定，DNA测序；ATXβ重组核酸序列为SEQIDNO:2；（3）重组HEK293-(pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR)细胞株的构建和筛选鉴定正确的重组表达质粒pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR经SwaI酶线性化处理后，利用Lippfectin2000TM阳离子转染试剂介导进入HEK293宿主细胞内；转染后无血清不完全DMED培养基更换为含10%胎牛血清（FBS）DMEM完全培养基，获得重组表达细胞株；按照10%～20%接种量接种培养，分别用10nM、50nM、250nM、500nM、1000nM氨甲喋呤(amethopterin,MTX)梯度加压筛选，采用有限稀释法亚克隆获得稳定高表达ATX单克隆细胞株；（4）重组ATX蛋白的表达经MTX加压筛选获得的重组HEK293-(pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR)细胞株，采用分批补料培养方式，利用FreeStyle293expressionmedium培养基扩大培养：按照10～15%的细胞接种量接种至2.5L体积转瓶培养；初始培养体积为200ml，第24h补料200ml，第48h补料300ml，第60h补料500ml，总体积至1.2L体积；培养条件为转速140～160rpm，35～37℃，5%CO2；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5mmol/L和1.2mmol/L，pH保持在7.0～7.4之间；（5）重组ATX蛋白纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵峰梅，赵邑，张全爱，
申请(专利权)人：山西省生物研究所，
类型：发明
国别省市：山西,14