重组糖蛋白生产中的细胞生长和糖基化的调节制造技术

本发明专利技术涉及用于在增强细胞生长或生物质产生的条件和影响在发酵培养条件下由真核细胞产生的所表达的糖蛋白的N‑糖基化成熟度的条件之间进行选择的方法。因此，在本发明专利技术的方法中，在针对期望的最终结果定制的培养基中培养产生糖蛋白的细胞。本发明专利技术还包括该培养基及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请涉及微量元素在重组糖蛋白发酵生产中的细胞生长和蛋白质糖基化中发挥的作用。背景重组糖蛋白通常通过使用真核表达系统的发酵生产工艺来产生。蛋白质的翻译后糖基化对于满足重要的物理化学和生物学性质和功能(如蛋白质溶解度、稳定性、清除率、免疫原性和免疫效应子功能)来说是至关重要的。糖蛋白的糖基化状态受严格调控，并且，即使是糖基化中的微小差异也可能具有显著效果。然而，由于大量的酶参与糖基化，特别是参与N-糖基化，因此该途径是真核细胞中进行的最复杂的翻译后修饰。在糖蛋白中，糖要么附接至天冬酰胺侧链中的酰胺氮原子(N-连接)，要么附接至丝氨酸或苏氨酸侧链中的氧原子(O-连接)。糖基化开始于在内质网中的N-连接的形成，所谓的“核心糖基化”。在这之后，多肽被输送到高尔基体，在那里，添加O-连接的糖并且以多种不同方式修饰N-连接的糖链，例如，通过去除甘露糖残基，添加N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或岩藻糖和/或唾液酸残基。金属及其离子在生物学中发挥重要作用(Yannone等人,Current Opinion in Biotechnology 23.1(2013)89-95)。已经报告，39个基本生物学元素中，26个是金属。此外，这些金属实现其生物学功能所需的有效浓度有显著差异。必需金属可以分为宏量营养元素，如钙、钾或镁，和微量营养元素如微量金属铁、锌、锰或铜，以及超微量元素，如钒和钨。虽然这些必需金属是生物内环境稳定的关键，但是当浓度超过它们的生物学功能所必需的浓度时，它们能是有毒的。因此，全身金属浓度的严格调控对于生物内环境稳定来说是非常重要的。过渡金属铜、铁、锌和锰根据它们的生物学活性浓度被分类为微量元素，并且在细胞稳态中起关键作用。它们被发现于许多酶的活性位点中，如描述于Fraga和Fraga(Mol.Aspects Med.26.4-5(2005)235-44)。多年以来，已经使用动物饲养和细胞培养实验研究了微量元素在细胞生长中的作用。Ham等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 53(1965)288-93)已经显示微量元素是成功的细胞培养所需要的。人们对微量元素在蛋白质糖基化中的作用也有很大的兴趣，但是，不同微量元素的详细酶促贡献和金属阳离子在糖基化途径中的相互作用仍然是相对未知的。在一般情况下，糖基化酶的活性取决于二价微量元素(如，Zn2+，Mn2+，Ca2+，Mg2+)的可用性、pH环境和核苷磷酸酯(UTP，GTP，CTP)和相应的糖衍生物(UDP-Gal，UDP-GlcNAc，GDP-Fuc，CMP-唾液酸)的可用性。Kaminska等人(Glyconj.J.15.8(1998)783-88)研究了二价阳离子对于糖蛋白6-α-L-岩藻糖基转移酶活性的作用，并发现，虽然二价阳离子如Mg2+和Ca2+激活这种酶，但是Cu2+、Zn2+和Ni2+强烈抑制这种酶的活性。Witsell等人，(J.Biol.Chem.265.26(1990)15731-37)描述了特定的二价阳离子在天然乳腺高尔基小泡中的半乳糖基转移酶的激活中的作用。Crowell等人(Biotechnol.Bioeng.96.3(2007)538-49)描述了，在采用应激培养的后期工艺阶段，微量元素(尤其是锰)与其他培养因素(如，氨基酸可用性)相互作用，从而调控蛋白质糖基化。Gawlitzek等人(Biotechnol.Bioeng.103.6(2009)1164-75)观察到细胞培养条件，如，锰和铁浓度，比生产率增强剂丁酸盐，甲状腺素和培养物pH值可以控制CHO细胞中表达的重组糖蛋白的N-糖基化位点占据。如US 2007/0161084中概述的，一些参与糖基化的酶利用不同的阳离子作为辅因子。在该申请中，专利技术人发现，通过使表达糖蛋白的哺乳动物宿主细胞生长于含有无毒量的锰的培养基中，可以改善糖蛋白的唾液酸化，(即向糖蛋白上的碳水化合物链添加末端唾液酸残基)，并且尤其是促红细胞生成素的唾液酸化。锰可以存在于初始生长培养基上，或者可以在快速细胞生长阶段之后加入，或者可以在一个或两个收获周期之后加入。锰在细胞生长中的作用及其活性浓度是有争议的。据报道，锰对于正常细胞生长和发展是必需的，但同时在高浓度下有毒(Au等人,Neurotoxicology 29.4(2008)569-76)。例如，已经表明锰结合至位于细胞表面的整合素并激活MAP激酶，ERK1和ERK2，这两者均是关于细胞生长的重要开关(Roth等人,Neurotoxicology 23.2(2002)147-57)。另一方面，Roth等人也表明锰通过发动许多凋亡因子而与细胞死亡和细胞的凋亡有关，所述凋亡因子最终通过破坏线粒体功能和诱导失去ATP导致细胞死亡。当从细胞培养基中去除铁时，锰的毒性作用相当强，这是因为铁和锰竞争同一细胞膜穿梭物DMT1(Roth等人)。US 2008/0081356描述了这样的方法，该方法通过使用包含10和600nM之间的摩尔累积浓度的锰和低于约8mM的摩尔累积谷氨酰胺浓度的培养基，在商业规模的细胞培养中大规模生产具有改变的糖基化模式的糖蛋白。WO 2012/149197描述了这样的方法，该方法通过向生产培养基补充锰和/或半乳糖，在CHO和NSO细胞系中调节重组表达的蛋白质(并且尤其是抗体)的半乳糖基化谱。Mn2+作为β-1,4-半乳糖基转移酶活性的辅因子的重要性先前已由Ramakrishnan等人，(J.Mol.Biol.357.5(2006)1619-33)描述。已经报道，锌对于细胞增殖和分化(尤其对于DNA合成和有丝分裂的调控)是至关重要的。锌是大量蛋白质的结构组分，所述蛋白质包括转录因子和来自细胞信号通路的酶，如第二信使代谢、蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性(Beyersmann等人,Biometals 14.3-4(2001)331-41)。因此，生物可利用的锌已与细胞增殖相关联。铁是细胞生长调节中的关键角色。先前已经报道将铁或其转运蛋白转铁蛋白补充到化学成分确定的细胞培养基中对于生物质产生是至关重要的。例如，已经表明铁在无血清培养基中促进C6胶质瘤和L1210白血病癌细胞系的细胞生长(Basset等人,Carcinogenesis 6.3(1985)355-59)。铁在细胞生长中的基础作用通过能够穿过质膜的螯合剂得到了进一步证明，所述螯合剂通过结合细胞内的金属限制了其生物利用度。活性剂如去铁胺(desferrioxamine)和去铁硫辛(desferrithiocin)在培养物中抑制多种肿瘤细胞的生长(Reddel等人,Exp.Cell Res.161.2(1985)277-84和Basset等人，同上)并大大降低T细胞增殖(Polson等人,Immunology 71.2(1990)176-81和Pattanapanyasat等人,Br.J.Haematol.82.1(1992)13-19)。在此，可能的细胞生长抑制机制是铁剥夺，其与降低的核糖核苷酸还原酶活性和脱氧核糖核苷酸的降低的量相关。这随后导致S期中的有丝分裂停止。向培养基中添加铁逆转生长抑制(Lederman等人,Blood 64.3(1984)748-53)。WO 9本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在发酵培养条件下在真核细胞中产生重组糖蛋白的方法，所述方法包括在培养期间调整培养基中铁、铜、锌和锰中每一种的浓度以影响生物质产生和/或所表达的糖蛋白中的N‑聚糖成熟度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.27 EP 14157030.91.用于在发酵培养条件下在真核细胞中产生重组糖蛋白的方法，所述方法包括在培养期间调整培养基中铁、铜、锌和锰中每一种的浓度以影响生物质产生和/或所表达的糖蛋白中的N-聚糖成熟度。2.根据权利要求1所述的方法，其中所表达的糖蛋白是成熟的N-糖基化糖蛋白、成熟的非岩藻糖基化糖蛋白或不成熟的非岩藻糖基化糖蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其中增加铁、铜、锌和锰中每一种的浓度以有利于增加的生物质产生。4.根据权利要求1所述的方法，其中在培养基中增加锌和锰中每一种的浓度并且在培养基中降低铁和铜中每一种的浓度以增加所表达的N-糖蛋白的成熟度。5.用于在发酵培养条件下在真核细胞中产生重组糖蛋白的方法，所述方法包括在培养期间增加培养基中锌和锰的浓度以增加所表达的糖蛋白中的N-聚糖成熟度。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所表达的糖蛋白的碳水化合物部分具有G0、G1或G2结构。7.根据权利要求1所述的方法，其中在培养基中降低铁、铜、锌和锰中每一种的浓度以有利于不成熟的非岩藻糖基化糖蛋白的生产增加。8.根据权利要求3所述的方法，其中浓度被调整为：(a)铁—从15μM至多于80μM；(b)铜—从0.3μM至多于2.5μM；(c)锌—从20μM至多于50μM；和(d)锰—从0.01μM至多于3μM。9.根据权利要求4或6所述的方法，其中浓度被调整为：(a)铁—从0μM至25μM；(b)铜—从0μM至0.1μM；(c)锌—从20μM至多于50μM；和(d)锰—从0.01μM至多于3μM。10.根据权利要求5或6所述的方法，其中浓度被调整为：(a)锌—从20μM至多于50μM；和(b)锰—从0.01μM至多于3μM。11.根据权利要求7所述的方法，其中浓度被调整为以下任一：(i)(a)铁—从0μM至35μM；(b)铜—从0μM至1μM；(c)锌—从0μM至20μM；和(d)锰—从0μM至0.01μM；或者(ii)(a)铁—从15μM至多于80μM；(b)铜—从0.3μM至多于2.5μM；(c)锌—从0μM至20μM；和(d)锰—从0μM至0.01μM。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中糖蛋白对于真核细胞是外源性的或内源性的，任选地其中糖蛋白是结构性糖蛋白、激素、抗体或酶。13.根据权利要求12所述的方法，其中糖蛋白是抗体，任选地其中抗体是治疗性或诊断性抗体，任选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中真核细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。15.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·波普，N·博康，G·德拉内尔，S·埃斯林格尔，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH