一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法技术

本发明专利技术公开了一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法。步骤为，强阳离子交换层析：将澄清后的哺乳动物细胞培养物上清加样到强阳离子交换层析树脂上，并使用洗脱缓冲液进行洗脱得到第一重组人神经生长因子；疏水层析：将第一重组人神经生长因子处理后加样到疏水作用层析树脂上，并使用洗脱缓冲液洗脱得到第二重组人神经生长因子即可。所述方法操作步骤更少，缩短了生产周期、提高了回收率，纯度高，均一性好，体外生物活性极高，通常大于1.5×105 U/mg，远高于市场中注射用鼠神经生长因子（0.5×105 U/mg）。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物纯化方法，尤其涉及一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法。
技术介绍
神经生长因子（NGF）是最早发现的神经系统营养因子，其作用广泛，对中枢和周围神经细胞的生长、发育、分化及再生具有重要作用，其中β亚单位是NGF的活性区。通常所说的β-hNGF是118个氨基酸成熟肽。在人体内，β-NGF的表达有下列过程：1.β-NGF编码序列（723bp）翻译为prepro-hNGF（241aa），包括信号肽（1-18aa）、导肽（19-121aa）、成熟肽（122-241aa）；2.内质网上，信号肽被水解，形成pro-hNGF，包括导肽与成熟肽。导肽末端有4个氨基酸残基（118-121aa）Arg-Ser-Lys-Arg，为哺乳动物前体蛋白加工酶识别位点，导肽在高尔基体中被前体蛋白加工酶水解，形成hNGF(120aa)；3.hNGF在7ShNGF中γ亚基作用下切除C端的ArgAla形成成熟肽（118aa）。目前商品化的神经生长因子药物为鼠源β-mNGF如恩经复®（NOBEX），是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化获得。广泛应用于眼科、神经外科、骨科、神经内科、儿科、内分泌科神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗。虽然鼠源神经生长因子（mNGF）与人源神经生长因子（hNGF）具有极高的同源性，但动物源性的蛋白质存在潜在的免疫原性，且生产需要大量的合格的雄性小鼠颌下腺。因此开发基因工程技术重组表达hNGF的制备方法，将是未来NGF药物研发的趋势。在众多表达系统中，相对于原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等，哺乳动物细胞表达系统具有许多优势，例如正确有效的翻译后修饰，是蛋白质能正确的折叠成最接近天然分子的结构；能有效分泌蛋白质至细胞外，且宿主本底表达较低，利于纯化等。重组hNGF发酵液上清中，包含有宿主细胞污染物、hNGF的不同变体（如错误折叠形式、电荷异构体、部分加工的前体序列、糖基化的形式等）。开发一种将hNGF从这些污染物及错误变体形式中分离出来的方法，是获得高质量重组hNGF的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生产周期短、操作步骤少、回收率高、纯度高、均一性高、体外活性高的从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法。为实现上述目的，本专利技术提供一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，步骤为，强阳离子交换层析：将澄清后的哺乳动物细胞培养物上清加样到强阳离子交换层析树脂上，并使用洗脱缓冲液进行洗脱得到第一重组人神经生长因子；疏水层析：将第一重组人神经生长因子处理后加样到疏水作用层析树脂上，并使用洗脱缓冲液洗脱得到第二重组人神经生长因子即可。进一步，所述哺乳动物细胞培养物为CHO细胞培养物。进一步，所述强阳离子交换层析步骤中，澄清后的哺乳动物细胞培养物上清的pH为5.0-8.0，电导低于10mS/cm；优选的，pH为6.0。进一步，所述强阳离子交换层析步骤中，缓冲液洗脱条件为：pH5.0-8.0，升高的盐浓度梯度，；优选的，为线性梯度洗脱，盐浓度梯度为0.2-0.8mmol/L，梯度长度10-30柱体积。进一步，所述疏水层析步骤中，第一重组人神经生长因子处理后的pH为5.0-8.0，盐浓度为0.5M-1.5M。进一步，所述疏水层析步骤中，疏水作用层析的树脂配基为苯基、辛基或丁基。进一步，所述疏水层析步骤中，洗脱缓冲液的洗脱条件为：pH5.0-8.0，梯度洗脱，降低的盐浓度梯度，优选的，为线性梯度洗脱，梯度长度10-30柱体积；任选的，所述盐为硫酸铵、柠檬酸盐、乙酸铵或氯化钠。进一步，所述疏水层析的树脂为PhenylSepharoseHighPerformance。进一步，所述疏水层析的洗脱缓冲液中含有体积百分比为5%-20%的醇试剂；优选乙醇试剂。进一步，所述疏水层析的洗脱缓冲液中含有体积百分比为0.1%-1%的非离子型表面活性剂；优选的，含有体积百分比为0.1%-1%的Tween80。研究表明，功能活性的β-hNGF是一个同源二聚体结构，每个单体中有三对二硫键，从而形成半胱氨酸簇结构。这个特殊的结构为β-hNGF生物功能的维持所必须。β-hNGF二聚体由两个相同的单体组成，每个单体的折叠由三个伸长的扭曲的β转角连接的三对反平行β折叠组成，而且每个单体的上部是三个β发夹环，中部是二硫键核心。整个分子呈长形，有一个平的疏水性很强的表面，该表面使两个单体间通过“半胱氨酸结(cysteine-knot)”连接成二聚体。β-hNGF单体保守的分子结构主要包括两对反向平行的β折叠，β折叠构成了NGF长而扁平的构型，其中包括六个半胱氨酸残基（cysteines），组成三对二硫键。这三对二硫键为组成NGF的结构提供刚性支持，其中两个二硫桥Cys58-Cys108、Cys68-Cys110和内部的残基59-67及109形成一个环结构，第三个二硫桥Cys15-Cys80穿过该环形成一个紧密包裹的“半胱氨酸结”，这种结构使得两个NGF单体中的β折叠互相包裹，组成一个较大的由芳香族氨基酸残基构成的疏水单体交界面，沿着两个单体平面的轴形成了NGF二聚体的活性分子，组成疏水面的氨基酸残基对NGF三维结构的形成起了主要作用，还有一些氨基酸残基通过氢键和盐键，辅助支持三维结构的稳定性。当与高亲和力TrkA受体结合时，保守结构，尤其是β3β4折叠片对形成配体受体复合物起到支持作用，因为这种结合需在NGF二聚体的疏水面上进行。哺乳动物细胞培养的重组β-hNGF，其发酵液上清中含有不正确蛋白水解加工的变体，如含部分前体序列变体，前体NGF，杂交前体NGF和剪接的前体NGF序列，还存在糖基化的NGF以及不正确蛋白水解加工变体的糖基化形式。糖基化形式可形成分子量较高的聚合体，可能在体内产生不良的免疫原性。由于这些hNGF变体的疏水性不如天然结构hNGF，因此可以采用疏水作用层析分离这些变体形式，在hNGF洗脱峰的前缘，先于天然结构hNGF洗脱下来。此外，哺乳动物细胞培养的重组hNGF，发酵液上清中还存在电荷异构体，如氨基甲酰化、氧化、异天冬氨酸、脱酰胺化和某些剪接形式（如C端截短）。通过阳离子交换层析可以将这些变体与天然结构hNGF分离开来。本专利技术所述方法，组合了强阳离子交换层析与疏水层析（HIC）两步层析，通过强阳离子交换层析从哺乳动物细胞发酵液上清中捕获、富集重组hNGF，并分离电荷异构体；通过疏水层析精细纯化重组hNGF，去除不正确的蛋白水解加工变体及糖基化形式，最终获得的组份是几乎纯的重组人神经生长因子，几乎不含神经生长因子变体，体外生物活性极高。hNGF的纯度通常大于99.0%，体外生物活性可达1.5×105U/mg。使用含成熟118氨基酸的hNGF编码DNA序列的重组哺乳动物细胞发酵hNGF。优选的，哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）。为了使重组hNGF能正确折叠、加工并分泌至培养液中，编码DNA序列应含信号肽序列及hNGF导肽序列。一种优选的培养模式为流加方式进行补料培养，至细胞活力低于70%结束。强阳离子交换层析发酵后，收获细胞培养液。进行层析前需澄清培养液，优选的，使用深层过滤。调整细胞培养液pH为5.0-8.0，优选的pH为6.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，步骤为，强阳离子交换层析：将澄清后的哺乳动物细胞培养物上清加样到强阳离子交换层析树脂上，并使用洗脱缓冲液进行洗脱得到第一重组人神经生长因子；疏水层析：将第一重组人神经生长因子处理后加样到疏水作用层析树脂上，并使用洗脱缓冲液洗脱得到第二重组人神经生长因子即可。

【技术特征摘要】
1.一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，步骤为，强阳离子交换层析：将澄清后的哺乳动物细胞培养物上清加样到强阳离子交换层析树脂上，并使用洗脱缓冲液进行洗脱得到第一重组人神经生长因子；疏水层析：将第一重组人神经生长因子处理后加样到疏水作用层析树脂上，并使用洗脱缓冲液洗脱得到第二重组人神经生长因子即可。2.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞培养物为CHO细胞培养物。3.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述强阳离子交换层析步骤中，澄清后的哺乳动物细胞培养物上清的pH为5.0-8.0，电导低于10mS/cm；优选的，pH为6.0。4.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述强阳离子交换层析步骤中，缓冲液洗脱条件为：pH5.0-8.0，升高的盐浓度梯度；优选的，为线性梯度洗脱，盐浓度梯度为0.2-0.8mmol/L，梯度长度10-30柱体积。5.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述疏水层析步骤中，第一重...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文宇，黄奋飞，章永垒，白羊，陈星，陈胜亮，阮卡，葛平辉，邹有土，马燕玲，王明灶，
申请(专利权)人：未名生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35