一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系及应用制造技术
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于精原干细胞培养
，具体涉及一种无生长因子添加的精原干细胞培养体系及其应用，特别涉及一种高效表达重组生长因子GDNF的STO滋养层细胞和成分明确的精原干细胞培养基。
技术介绍
精原干细胞是位于雄性哺乳动物睾丸曲细精管基底膜上的生殖干细胞。它在整个睾丸的生殖细胞中只占0.02％～0.03％，但却是唯一的生殖干细胞，可以进行自我更新和分化，维持整个雄性动物生命过程中的精子发生。精原干细胞的分离培养对于研究精原干细胞的增殖和体外分化及精子发生的机制都起着非常重要的作用。早在2003年已经有一些实验室可以在体外培养精原干细胞较长时间，其中比较有代表性的是BrinsterRL和ShinoharaT实验室。Brinster实验室采用小鼠囊胚上皮细胞(STO)为滋养层细胞而Shinohara实验室采用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为滋养层细胞。这两种培养方法都需要添加复杂的生长因子，包括：神经胶质源性生长因子(GDNF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)，神经胶质源性生长因子受体-α1(GFRα-1)，重组白血病抑制因子(LIF)，胰岛素样生长因子-1(IGF...
【技术保护点】
一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系，其特征在于包括含十二种明确化学成分组成的培养基和过表达生长因子GDNF的滋养层，所述培养基每500mL含有牛血清白蛋白0.6wt.%，转铁蛋白100μg/mL，不饱和脂肪酸15.2μeq/L，亚硒酸钠6×10‑8M， 2‑巯基乙醇100μM，胰岛素25μg/mL， 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸10mM，腐胺120μM，青霉素50units/mL，链霉素50μg/mL， L‑谷氨酰胺2mM，其余为基础培养基MEMα，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸包括：亚麻酸5.6mM，十八烯酸13.4 mM，棕搁油酸2.8 mM，亚油酸35....
【技术特征摘要】
2016.05.30 CN 20161036977171.一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系，其特征在于包括含十二种明确化学成分组成的培养基和过表达生长因子GDNF的滋养层，所述培养基每500mL含有牛血清白蛋白0.6wt.%，转铁蛋白100μg/mL，不饱和脂肪酸15.2μeq/L，亚硒酸钠6×10-8M，2-巯基乙醇100μM，胰岛素25μg/mL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mM，腐胺120μM，青霉素50units/mL，链霉素50μg/mL，L-谷氨酰胺2mM，其余为基础培养基MEMα，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸包括：亚麻酸5.6mM，十八烯酸13.4mM，棕搁油酸2.8mM，亚油酸35.6mM，十六烷酸31mM，十八酸11.6mM，无水乙醇为溶剂；所述的过表达生长因子GDNF的滋养层细胞每2×105细胞24小时GDNF分泌量为4.13ng/mL。2.根据权利要求1所述无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系，其特征在于所述过表达GDNF的滋养层细胞的制备方法为：1）用小鼠睾丸的cDNA为模板，通过PCR扩增反应，扩增出723bp的GDNF基因编码区片段，引物如下：GDNF-CDS-F：GCTCTAGAGCCACCATGAAGTTATGGGATGTC；GDNF-CDS-R：CGGGATCCGATACATCCACACCGTTTAG；2）通过琼脂糖凝胶电泳验证正确的GDNF开放阅读框并切胶回收PCR产物；3）pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体经过限制性内切酶XbaI和BamHI酶切消化后，琼脂糖凝胶电泳验证回收；4）酶切后pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体和回收的PCR产物连接，构建出pCDH-EF1-GDNF-T2A-Puro表达载体；5）在10cm细胞培养皿中培养293T细胞，用于包装病毒，病毒体系：ddH2O:420μL，2MCaCl2:60μL，pSPAX2:2.5μg，pMD2.G:1μg，（所制备的表达载体）Plasmid:3.3μg，2×HBS:500μL，边涡旋边均匀滴加，空气吹打3次，再混匀吹打3次，均匀滴加至培养皿内，12h后换STO培养液，48h后收集培养皿中培养液，离心1500g，3min，将病毒上清用0.45μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴鑫，贾媛媛，薛园媛，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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