一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系及应用制造技术

一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系及应用，包括成分明确的精原干细胞培养基和过表达生长因子GDNF的滋养层细胞。利用本发明专利技术方法，可以长期体外培养精原干细胞，通过移植实验验证其干细胞特性与传统培养方法所培养的精原干细胞无差异。与传统培养方法相比，无需添加任何昂贵的重组生长因子及胎牛血清，培养基成分十分清晰，重复性好。应用本发明专利技术方法所培养的精原干细胞具备完整的再生潜能和无限增殖的能力。本发明专利技术方法培养简便，经济且高效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于精原干细胞培养
，具体涉及一种无生长因子添加的精原干细胞培养体系及其应用，特别涉及一种高效表达重组生长因子GDNF的STO滋养层细胞和成分明确的精原干细胞培养基。
技术介绍
精原干细胞是位于雄性哺乳动物睾丸曲细精管基底膜上的生殖干细胞。它在整个睾丸的生殖细胞中只占0.02％～0.03％，但却是唯一的生殖干细胞，可以进行自我更新和分化，维持整个雄性动物生命过程中的精子发生。精原干细胞的分离培养对于研究精原干细胞的增殖和体外分化及精子发生的机制都起着非常重要的作用。早在2003年已经有一些实验室可以在体外培养精原干细胞较长时间，其中比较有代表性的是BrinsterRL和ShinoharaT实验室。Brinster实验室采用小鼠囊胚上皮细胞(STO)为滋养层细胞而Shinohara实验室采用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为滋养层细胞。这两种培养方法都需要添加复杂的生长因子，包括：神经胶质源性生长因子(GDNF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)，神经胶质源性生长因子受体-α1(GFRα-1)，重组白血病抑制因子(LIF)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，重组干细胞因子(SCF)等。这些重组生长因子价格昂贵，且需要持续添加，培养成本十分昂贵(尽管只有GDNF是目前公认的必须生长因子)，精原干细胞的增殖缓慢，平均倍增期在一周左右，使得培养操作也变得十分繁琐复杂。此外以往有文献报道需要血清支持精原干细胞的培养工作，血清的成分极其复杂，所包含的各成分对细胞生长的作用也不明确，且培养的细胞易分化，不支持体外长期培养。为解决上述问题，我们专利技术了一个简单高效的体系，将GDNF基因转入STO细胞使其高效表达GDNF蛋白，用这种高效表达GDNF蛋白的STO细胞作为滋养层，同时采用一种无血清的精原干细胞培养液，不需要额外添加任何生长因子即可体外建系培养精原干细胞。此体系培养的精原干细胞与传统方法比较，增殖速率无显著差异，同时具备完整的再生潜能。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种无生长因子添加的精原干细胞培养体系及应用，无需添加任何重组生长因子同时克服含血清培养体系中成分不明的困难，可完全支持精原干细胞的体外培养。通过本专利技术公开的培养体系及高效表达重组生长因子GDNF的STO滋养层可以避免血清中复杂成分对于精原干细胞增殖的影响，不需要外源性重组生长因子的添加，在促进精原干细胞快速增殖的同时维持其干性，极大减少培养成本，简化了培养过程。技术方案：一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系，包括含十二种明确化学成分组成的培养基和过表达生长因子GDNF的滋养层，所述培养基每500mL含有牛血清白蛋白(BSA)0.6wt.％，转铁蛋白(Tf)100μg/mL，不饱和脂肪酸(FFA)15.2μeq/L，亚硒酸钠(Na2SeO3)6×10-8M，2-巯基乙醇(2-ME)100μM，胰岛素(InsuLin)25μg/mL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPESBUFFER)10mM，腐胺(Putrescine)120μM，青霉素(Penicillin)50units/mL(Gibco15140122(货号))，链霉素(Streptomycin)50μg/mL(Gibco15140122(货号))，L-谷氨酰胺(L-glutamine)2mM，其余为基础培养基MEMα，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸(FFA100meq/L)包括：亚麻酸(Linolenicacid)5.6mM，十八烯酸(Oleicacid)13.4mM，棕搁油酸(Palmitoleicacid)2.8mM，亚油酸(Linoleicacid)35.6mM，十六烷酸(Palmiticacid)31mM，十八酸(Stearicacid)11.6mM，无水乙醇为溶剂。所述的过表达生长因子GDNF的滋养层细胞每2×105细胞24小时GDNF分泌量为4.13ng/mL。所述过表达生长因子GDNF的滋养层的制备方法为：1)用小鼠睾丸的cDNA为模板，通过PCR扩增反应，扩增出723bp的GDNF基因编码区片段，，引物如下：GDNF-CDS-F：GCTCTAGAGCCACCATGAAGTTATGGGATGTC；GDNF-CDS-R：CGGGATCCGATACATCCACACCGTTTAG；2)通过琼脂糖凝胶电泳验证正确的GDNF编码区序列并切胶回收PCR产物；3)pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体(SystemBiosciences公司购买)经过限制性内切酶XbaI和BamHI酶切消化后，琼脂糖凝胶电泳验证回收；4)酶切后pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体和回收的PCR产物连接，构建出pCDH-EF1-GDNF-T2A-Puro表达载体；5)在10cm细胞培养皿中培养293T细胞(人肾上皮细胞)，用于包装病毒，病毒体系：ddH2O:420μL，CaCl2(2M):60μL，pSPAX2:2.5μg，pMD2.G：1μg，所制备的表达载体Plasmid:3.3μg，2×HBS:500μL，边涡旋边均匀滴加，空气吹打3次，再混匀吹打3次，均匀滴加至培养皿内，12h后换STO培养液，48h后收集培养皿中培养液，离心1500g，3min，将病毒上清用0.45μm滤器过滤分装，-80℃保存；6)0.1％明胶孵育12孔板30min，吸去明胶，加入1mLSTO培养液/孔，1mL病毒上清重悬0.8×105个STO细胞/孔，接种于12孔板；7)48h后收集转入病毒的STO细胞两孔，提取RNA及蛋白，验证在STO细胞中过表达GDNF成功；8)对验证过表达成功的STO细胞传代至10cm培养皿培养，并在细胞长满后用丝裂霉素C(MITC10μg/mL)在37℃孵育3小时，每隔半小时摇晃混匀一次，10mLHBSS荡洗3次，去除残留的丝裂霉素C，质量浓度0.25％的胰酶(Trypsin-EDTA)1mL37℃消化5min，3mLSTO培养液终止消化，收集细胞，600g5min4℃离心，按1×106个/细胞mL冻存，冻存液为90％体积STO培养液和10％体积二甲基亚砜(DMSO)，-80℃冻存过夜后转移至液氮，得到高效表达GDNF的STO细胞系，作为精原干细胞的滋养层细胞；上述STO培养液500mL含有:基础高糖培养基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-链霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巯基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm滤器过滤。所述无生长因子添加的精原干细胞培养体系在精原干细胞培养中的应用。所述精原干细胞为哺乳动物精原干细胞。所述哺乳动物包括：小鼠，大鼠，家兔和恒河猴。应用步骤包括：1)提前两天铺板，预热STO培养液，取全新24孔细胞培养板，加入质量浓度为0.1％的明胶(gelatin)铺满板底，37℃孵育30min，取出冻存的丝裂霉素C处理过的高效表达GDNF的STO细胞，37℃水浴锅复苏，将细胞转移至15mL离心管，加入4mLSTO培养液，600g4℃5min离心，弃上清，STO培养液5mL重悬细胞沉淀，对细胞进行计数按0.9-1×105本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系，其特征在于包括含十二种明确化学成分组成的培养基和过表达生长因子GDNF的滋养层，所述培养基每500mL含有牛血清白蛋白0.6wt.%，转铁蛋白100μg/mL，不饱和脂肪酸15.2μeq/L，亚硒酸钠6×10‑8M， 2‑巯基乙醇100μM，胰岛素25μg/mL， 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸10mM，腐胺120μM，青霉素50units/mL，链霉素50μg/mL， L‑谷氨酰胺2mM，其余为基础培养基MEMα，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸包括：亚麻酸5.6mM，十八烯酸13.4 mM，棕搁油酸2.8 mM，亚油酸35.6 mM，十六烷酸31 mM，十八酸11.6 mM，无水乙醇为溶剂；所述的过表达生长因子GDNF的滋养层细胞每2×105细胞24小时GDNF分泌量为4.13ng/mL。

【技术特征摘要】
2016.05.30 CN 20161036977171.一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系，其特征在于包括含十二种明确化学成分组成的培养基和过表达生长因子GDNF的滋养层，所述培养基每500mL含有牛血清白蛋白0.6wt.%，转铁蛋白100μg/mL，不饱和脂肪酸15.2μeq/L，亚硒酸钠6×10-8M，2-巯基乙醇100μM，胰岛素25μg/mL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mM，腐胺120μM，青霉素50units/mL，链霉素50μg/mL，L-谷氨酰胺2mM，其余为基础培养基MEMα，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸包括：亚麻酸5.6mM，十八烯酸13.4mM，棕搁油酸2.8mM，亚油酸35.6mM，十六烷酸31mM，十八酸11.6mM，无水乙醇为溶剂；所述的过表达生长因子GDNF的滋养层细胞每2×105细胞24小时GDNF分泌量为4.13ng/mL。2.根据权利要求1所述无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系，其特征在于所述过表达GDNF的滋养层细胞的制备方法为：1）用小鼠睾丸的cDNA为模板，通过PCR扩增反应，扩增出723bp的GDNF基因编码区片段，引物如下：GDNF-CDS-F：GCTCTAGAGCCACCATGAAGTTATGGGATGTC；GDNF-CDS-R：CGGGATCCGATACATCCACACCGTTTAG；2）通过琼脂糖凝胶电泳验证正确的GDNF开放阅读框并切胶回收PCR产物；3）pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体经过限制性内切酶XbaI和BamHI酶切消化后，琼脂糖凝胶电泳验证回收；4）酶切后pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体和回收的PCR产物连接，构建出pCDH-EF1-GDNF-T2A-Puro表达载体；5）在10cm细胞培养皿中培养293T细胞，用于包装病毒，病毒体系：ddH2O:420μL，2MCaCl2:60μL，pSPAX2:2.5μg，pMD2.G:1μg，（所制备的表达载体）Plasmid:3.3μg，2×HBS:500μL，边涡旋边均匀滴加，空气吹打3次，再混匀吹打3次，均匀滴加至培养皿内，12h后换STO培养液，48h后收集培养皿中培养液，离心1500g，3min，将病毒上清用0.45μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴鑫，贾媛媛，薛园媛，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32