本发明专利技术公开一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，专用培养基成分主要包括bFGF、LIF、EGF、GDNF、wnt3a和FBS，分离和培养方法是将消化成单细胞的树鼩睾丸组织标记抗体后，利用流式细胞术或磁珠筛选获得Thy1+细胞群，将分选获得的树鼩睾丸Thy1+细胞转入培养皿中培养，至培养皿中出现三五成群的精原干细胞集落时，转入新的有丝裂霉素处理过的专用饲养层包被的培养皿中传代培养。本发明专利技术的细胞分选效率高，专用培养基成分确定，并避免了异源细胞的污染。培养方法简单高效，对树鼩精原干细胞的分离具有获得目标细胞率高，建立可持续传代细胞系成功率高、细增殖传代能力强和安全稳定的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，具体是涉及特异性分选树鼩睾丸中精原干细胞的抗体的筛选及建立可持续传代树鼩精原干细胞系的专用培养条件及细胞系的建立。属于干细胞研究领域。
技术介绍
树鼩(Tupaia belangeri)与啮齿类和非人灵长类比较在生物医学研究中有很多优势。在遗传、进化及生理生化特征上都很靠近灵长类。树鼩因具有体型小、生长发育周期短、繁殖力高、易饲养等优点，使其较非人灵长类动物(猴)有更高的实用性。但是，树鼩作为生物医学研究的实验动物在经历了近半个世纪的研究却仍未能得到应有的发展，基于树鼩的大部分研究工作仍缺少深度和广度，遗传操作手段的缺乏是制约树鼩不能广泛应用的重要原因之一。因此解决树鼩的基因操作难题对于成功建立疾病模型，解析疾病机理，推动树鼩在生物医学研究中的广泛应用具有重要意义。目前对树鼩基础生殖生物学的认识和了解非常有限，尚无法方便和准确地判断雌性树鼩的生殖周期导致难以获得早期胚胎，也缺乏相应的胚胎移植技术，因此在建立能遗传的基因修饰方法中，利用1-细胞胚胎或者胚胎干细胞对树鼩进行基因修饰的条件尚不成熟。精原干细胞是一类起源于原始生殖细胞，位于雄性哺乳动物曲细精管生精皮基膜内侧的具有高度自我更新和分化潜能的细胞。在精子发生这一特殊的细胞分化过程中，精原干细胞的地位极其重要,它既能维持自我更新能力,又可不断分化形成各阶段的生殖细胞并最终产生精子,承载着向下一代传递遗传信息的使命。鉴于其独具的生物学特性,精原干细胞在揭示精子的发生机制、治疗雄性不育和转基因动物等研究中具有重要价值然而，精原干细胞在成年哺乳动物睾丸中数量非常低，但在发育生物学研究过程中需要大量高活性、高纯度的精原干细胞。因此分离和纯化对于其开展深入研究非常重要。而利用精原干细胞作为基因操作的细胞载体，则可以避开早期胚胎收集和胚胎移植的双重难题，从而为解决树鼩基因操作难题另辟蹊径。已有研究表明：精原干细胞的分离纯化、饲养层细胞的制备、细胞培养基等因素对精原干细胞成功建系都有重要的影响。已有研究表明：在分离小鼠和绵羊精原干细胞时，可以使用特定的精原干细胞抗体也可以不使用特定的精原干细胞抗体就能获得纯度较高的精原干细胞。目前有关精原干细胞的标记物的研究虽已取得丰硕成果，但大多数研究主要集中在小鼠等啮齿类哺乳动物。树鼩作为新型模式动物，目前尚不具备专门的抗体，在其精原干细胞标记基因的寻找过程中，需要根据物种同源性来寻找特异的标记抗体。目前国内外尚无关于树鼩精原干细胞特异标记物的报道，对其精原干细胞的深入研究更是知之甚少。但是对于树鼩精原干细胞的分离，专利技术人曾尝试使用SSEA4、PLZF表面标记，都无法获得纯度较高的精原干细胞。已经建立的多种哺乳动物的精原干细胞体外培养体系中，常选用DMEM/F12、MEM、StemPro-34SFM及其StemPro-34supplement等基础培养基。同时，培养基中需添加一系列如非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和β-巯基乙醇等促进细胞生长的物质,还要根据不同物种精原干细胞的需要选择性添加如胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和干细胞因子(stem cell factor,SCF)等细胞因子。为维持精原干细胞增殖能力并抑制分化，在体外培养过程中还需使用MEF、Sertoli和STO等作为饲养层细胞。不同物种动物的干细胞分离培养所需的生长因子和调控通路存在较大的差异，在体外培养的不同阶段所需细胞因子也会存在差异，目前国内外尚无树鼩精原干细胞成功建系的报道。在饲养层的选择上，目前已报道的精原干细胞及胚胎干细胞培养方法中，大多选用小鼠MEF细胞或STO细胞作为饲养层，而丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层是培养哺乳动物SSCs的最佳饲养层。专利技术人也尝试用小鼠的MEF作为饲养层，但是一直无法成功。而且，未知成分对干细胞鉴定的干扰以及异源细胞污染的问题会影响干细胞培养体系的深入研究。更为棘手的问题是，上述饲养层细胞对于树鼩精原干细胞的建系毫无建树，导致一直以来无法解决树鼩精原干细胞体外长期培养的问题。参考文献1.Fan,Y.,Huang,Z.Y.,Cao,et al.Genome of the Chinese tree shrew.2013,Nat common 4,1426.2.Xu L,Zhang Y,Liang B,LüL-B,Chen C-S,Chen Y-B,Zhou J-M,Yao Y-G.The tree shrew under the spot light:emerging models of human diseases.Zool Res,2013.34(2)：59-69.3.Sargis EJ.New views on tree shrews:The role of Tupaiids in primate supraordinal relationships.Evolutionary Anthropology:Issues,News Rev,2004.13(2):56-66.4.de Rooij DG.Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells.Reproduction 2001；121(3):347-54.)(Weiss L.Histology:Cell and tissue biology,5th ed.New York:Elsevier Science Publishing 1983,1056-61.5.Izadyar F,Spierenberg GT,Creemers LB,den Ouden K,de Rooij DG.Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis.Reproduction 2002；124(1):85-94.6.Kanatsu-Shinohara M,Ogonuki N,Iwano T,Lee J,Kazuki Y,Shinohara T,et al.Genetic and epigenetic properties of mouse male germ line stem cells during long-term culture.Development 2005；132(18):4155-63.7.Tao Tan,Yanfeng Zhang,Weizhi Ji,Ping Zheng.miRNA Si本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，包括以下步骤：(1)树鼩精原干细胞的分离取3月‑1.5岁年龄树鼩睾丸，对树鼩睾丸消化，加入抗体human CD90/Thy1，利用流式细胞术或免疫磁珠分选法分离获得Thy1+细胞；(2)树鼩精原干细胞的原代培养将步骤(1)获得的Thy1+细胞接种在用明胶包被的培养皿中，使用培养树鼩精原干细胞的专用培养基进行培养，培养至培养皿中出现3‑5成群的精原干细胞集落；(3)树鼩精原干细胞的传代培养将步骤(2)培养的树鼩精原干细胞转入经处理后的饲养层细胞的培养皿中进行传代培养。
【技术特征摘要】
1.一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，包括以下步骤：(1)树鼩精原干细胞的分离取3月-1.5岁年龄树鼩睾丸，对树鼩睾丸消化，加入抗体human CD90/Thy1，利用流式细胞术或免疫磁珠分选法分离获得Thy1+细胞；(2)树鼩精原干细胞的原代培养将步骤(1)获得的Thy1+细胞接种在用明胶包被的培养皿中，使用培养树鼩精原干细胞的专用培养基进行培养，培养至培养皿中出现3-5成群的精原干细胞集落；(3)树鼩精原干细胞的传代培养将步骤(2)培养的树鼩精原干细胞转入经处理后的饲养层细胞的培养皿中进行传代培养。2.根据权利要求1所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的主要成分为:StemPro34基础培养液、stemPro34supplement、bFGF、LIF、hEGF、GDNF、wnt3a和FBS。3.根据权利要求2所述的培养树鼩精原干细胞的方法，其特征在于，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基以StemPro34培养基作为基础培养液，其中bFGF的终浓度为1-5ng/mL，LIF的终浓度为800-1200U/mL，EGF的终浓度的含量为5-15ng/mL，GDNF的终浓度30-50ng/mL，Wnt3a的终浓度为8-12ng/mL，FBS的体积浓度为8-12％，配制每10mL培养树鼩精原干细胞的专用培养液加入stemPro34supplement 250μL。4.根据权利要求3所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的配方中腐胺的终浓度为60μM、丙酮酸钠的终浓度为1mM、MEM-NEAA的终浓度为1mM、β-巯基乙醇的终浓度为0.1mM，L-谷氨酰胺的终浓度为2mM。5.根据权利要求4所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基以StemPro34培养基作为基础培养液，配制每10mL培...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑萍，李朝晖，班文赞，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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