本发明专利技术公开了一种HSV感染树鼩动物模型的构建、评估方法及应用。本发明专利技术通过单纯疱疹病毒HSV-1经眼睛接种感染树鼩，建立HSV感染树鼩动物模型，并利用PCR、qRT-PCR、免疫组化、免疫荧光、原位杂交、体外共培养实验、组织活病毒检测及病毒基因组定量等方法，对树鼩脑和三叉神经节组织的感染、病毒潜伏及重激活进行研究，鉴定及评估HSV急性和潜伏感染树鼩模型的有效性及实用性。本发明专利技术首次成功建立单纯疱疹病毒感染树鼩模型，能更好地模拟人类HSV-1感染，可为HSV-1感染机制及抗病毒药物治疗研究提供更好的实验动物模型；该动物模型重复性、稳定性好；该构建和评估方法操作简单，技术、设备要求低，成功率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种HSV感染树駒动物模型的构建、评估方法及其应用，属于人类疾病动物模型
技术背景单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV):是人类最常见的病原体，世界人口中超过80 %的人都感染过HSV，一旦感染则终身潜伏。可引起口唇疱疹、角膜炎、疱疹病毒性脑炎和生殖器疱疹。HSV能引起人类多种疾病，如銀口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。在感染宿主后，常在神经细胞中建立潜伏感染，激活后又会出现无症状的排毒，在人群中维持传播链，周而复始的循环。目前，啮齿类是研究疱疹病毒潜伏感染的主要实验动物，啮齿类的小鼠和家兔模型中已有HSV经眼睛接种感染的报道，但由于啮齿类与灵长类差距甚远，并不能完整地模拟人类疱疹病毒感染的情况。通常HSV-1经眼睛接种途径感染小鼠后，病毒会在小鼠的三叉神经节和中枢神经系统发生裂解感染，在神经元内大量复制，导致被感染的神经元死亡，引起动物大量死亡;然而，我们知道人类感染疱疹或病毒再激活时，并没有在疱疹组织部位失去知觉，表明在人类感觉神经中枢(包括三叉神经节)不存在神经元死亡，这是啮齿类模型无法解释的现象。此外，小鼠模型缺乏对病毒的临床再激活能力，家兔模型与人类感染的免疫反应差异较大，且家兔实验成本高。因此，建立一个与人类或灵长类更接近的动物模型，来研究单纯疱疹病毒潜伏感染机制显得尤为重要。树駆](Tupaia belangeri)在分类学上属哺乳纲，有胎盘类，是一个独立的目，称为攀駒目(Scandentia)，介于灵长目与食虫目之间。树駒具有体型小，易饲养和操作，管理方便，廉价经济，且其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物与人更为接近，解剖结构也更近似于人，因此其作为较理想的实验动物，已经被广泛地应用于医学与生物学的研究中。虽然19世纪七八十年代，Darai ,Schwaier等已经有关于HSV腹腔感染树駆]的报道，但目前尚未见关于树駒HSV潜伏感染模型的深入研究报道。建立最接近于人类的灵长类动物HSV感染模型，可以评估目前这些治疗方法的有效性和安全性，是将其最终应用于临床治疗的必经途径。
技术实现思路
鉴于现在对HSV病毒感染实验动物模型开发的需求，本专利技术拟设计一种HSV病毒感染模型的建立及评估方法，通过单纯疱疹病毒经眼睛接种感染树駒，建立HSV感染树駒模型，为研究疱疹类病毒的感染机制，致病机理及药物治疗研究提供更好的实验动物模型。本专利技术的技术方案:一种单纯疱疹感染树駒动物模型的构建方法是将HSV-1病毒经树駒眼睛接种感染HSV病毒，建立单纯疱疹感染树駒动物模型，包括以下步骤:(I)实验动物准备:准备6月-3岁龄雌性成年健康树駒；(2)树駒的麻醉及处理:用氯胺酮麻醉动物，将树駒固定于专用的小布袋中，称量并记录其体重，在树駒大腿内侧肌肉丰厚处注射盐酸氯胺酮，5分钟后，树駒处于麻醉状态；(3)病毒感染:将HSV-1病毒滴加到树駒两只眼膜上，即可得到单纯疱疹感染树駒动物模型。其中，步骤(3)中所述的HSV病毒为野生型HSV-1 17+或HSV-1 McKrae毒株。 进一步地，步骤(2)中所述的氯胺酮(ketamine)的用量为按树駆]体重为50mg/kg?100mg/kgo进一步地，步骤(3)中当采用HSV-117+病毒时，需要以Iml注射器针头划痕动物眼膜，即建立表面划痕，横竖各划痕十次，然后将HSV-1 17+病毒滴加到树駒眼膜。进一步地，步骤⑶中采用的病毒感染剂量为I X 14PFU/眼睛?I X 16PFU/眼睛。本专利技术提供了一种评估单纯疱疹感染树駒动物模型的方法，取材病毒感染树駒的三叉神经节(TG)和脑组织，利用PCR( Po Iymerase Chain React 1n )、qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain react1n)、免疫组化、免疫焚光、原位杂交、体外共培养实验、组织活病毒检测及病毒基因组定量等方法，对树駒脑和三叉神经节组织的感染、病毒潜伏及重激活进行研究，鉴定及评估HSV潜伏感染树駒模型。利用以上专利技术方法构建的单纯疱疹感染树駒动物模型在单纯疱疹病毒、单纯疱疹病毒性脑炎、单纯疱疹病毒性角膜炎等发病机制机理研究和治疗方面的应用。经研究和分析，在HSV-1感染的树駒三叉神经节中可检测到潜伏感染的HSV-1病毒，且潜伏的病毒可重激活;但三叉神经节中表现出一种温和的急性感染症状，检测不到有感染活性的病毒。这些结果表明树駒的HSV-1急性感染并不引起感觉神经元死亡，这一现象与人类疱疹病毒的感染情况相类似。人类疱疹病毒复发，大多引起皮肤疱疹，且疱疹患处并不失去痛觉。HSV-1感染的树駒脑组织中可检测到感染的HSV-1病毒，且病毒可潜伏和原位重激活，这些都与小鼠感染HSV模型有很大的区别，这一结果对病毒性脑炎的研究具有重要意义。本专利技术的有益效果:I)选用更接近于人类或灵长类的树駒，首次成功建立单纯疱疹病毒感染树駒模型，能更好地模拟人类HSV-1感染，可为HSV-1感染机制及抗病毒药物治疗研究提供更好的实验动物模型;2)用本专利技术的方法构建出单纯疱疹病毒感染树駒模型的病变特点与人类感染临床表现近似，模型重复性、稳定性好，适用于各种治疗性研究和相关的基础性研究，为进一步研究HSV-1相关特性、发病机理、及相关病毒感染疾病如脑炎等药物筛选、疫苗评价等方面的研究奠定了基础;3)该构建方法操作简单，技术、设备要求低，成功率高。【附图说明】图1为小鼠和树駒感染HSV-1后的存活率图；图2为小鼠和树駒TG中HSV-1活病毒滴度的检测比较图；图3为小鼠和树駒TG中HSV-1病毒基因组载量的检测量图；图4为原位杂交检测HSV-1感染的树駒TG的LAT信号图，其中图4A为对照组的树駒TG中检测不到LAT信号显示图，图4B为感染后第7天的树駒TG中检测到的LAT信号显示图，图4C为感染后第28天的树駒TG中检测到的LAT信号显示图，和4D为感染后第58天的树駒TG中检测到的LAT信号显示图；图5为树駒TG与RS-1细胞体外共培养图；图6为小鼠和树駒脑中HSV-1活病毒滴度的检测比较图；图7为免疫组化检测小鼠和树駒脑中的HSV-1抗原检测比较图，其中图7A为小鼠对照组中免疫组化检测不到HSV-1抗原信号图，图7B为小鼠感染HSV-1 5天后免疫组化检测到的HSV-1抗原信号图；图7C为树駒对照组中免疫组化检测不到HSV-1抗原信号图，图7D为树駒感染HSV-1 8天后免疫组化检测到的HSV-1抗原信号图；图8为潜伏感染的小鼠和树駒脑中HSV-1重激活率比较图，其中图8A为不同时间点潜伏感染的小鼠和树駒嗅球中HSV-1重激活率比较图，图8B为不同时间点潜伏感染的小鼠和树駒脑干中HSV-1重激活率比较图。【具体实施方式】为能进一步了解本专利技术的
技术实现思路
及特点，通过以下实施例，并配合附图详细说明，请参阅附图1-8。下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规实验方法。以下实施例中，A实验动物为6月_3岁龄雌性成年树鼠句(Tupaia belangeri chin本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单纯疱疹感染树鼩动物模型的构建方法，其特征在于将HSV‑1病毒经树鼩眼睛接种感染HSV病毒，建立单纯疱疹感染树鼩动物模型，包括以下步骤：(1)实验动物准备：准备6月‑3岁龄雌性成年健康树鼩；(2)树鼩的麻醉及处理：用氯胺酮麻醉动物，将树鼩固定于专用的小布袋中，称量并记录其体重，在树鼩大腿内侧肌肉丰厚处注射盐酸氯胺酮，5分钟后，树鼩处于麻醉状态；(3)病毒感染：将HSV‑1病毒滴加到树鼩两只眼膜上，即可得到单纯疱疹感染树鼩动物模型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周巨民，李丽红，陈桂俊，杨卫，郎丰超，杨丽萍，李卓然，李欣，王二林，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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