一种重组单纯疱疹病毒的中试生产工艺制造技术

一种重组单纯疱疹病毒的中试生产工艺，本发明专利技术采用生物反应器（Bioreactor）CelliGen微载体悬浮培养的方式进行大规模细胞培养，经细胞种植、循环培养、病毒接种、介质补充、细胞收集和细胞冻融等生产流程，最终进行病毒纯化的生产工艺。优点是：在本发明专利技术中，由于采用了第二代生物反应器进行悬浮培养方式等一系列先进和严格的生产工艺，保证了高纯度、高得率和高生物活性的重组单纯疱疹病毒制剂的获得，为重组疱疹病毒作为基因治疗载体及临床应用提供了应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组单纯疱瘆病毒制剂中试生产工艺，属于生物制品

技术介绍
在基因治疗和疫苗开发等研宄领域，重组病毒制剂由于具其自身独有的诸多优势一直是广大科研工作者研宄的热点问题。任何一种重组病毒制剂，在进行商业化生产和投入临床使用前，都必须进行中试生产研宄，以确保该病毒制剂较大产量产出的可行性以满足市场需要。对于病毒制剂的中试生产研宄，动物细胞的大规模培养技术和工艺无疑处于至关重要的位置。细胞大规模培养技术(large-scale culture technology)是指在人工条件下(设定pH、温度、溶氧等)所谓动物，在细胞生物反应器(b1reactor)中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。20世界60-70年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle)、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器(B1reactor)进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产:一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70年代以来，细胞培养用生物反应器有很大的发展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。八十年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。动物细胞是一种无细胞壁的真核细胞，生长缓慢，对培养环境十分敏感。采用传统的生物化工技术进行动物细胞大量培养，除了要满足培养过程必需的营养要求外，有必要建立合理的控制模型，进行pH和溶氧的最佳控制。细胞生物反应器可通过微机有序地定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的流量，使其保持最佳的比例来控制细胞培养液中的PH值和溶氧水平，使系统始终处于最佳状态，以满足动物细胞的生长对PH值和溶解氧的需要。如为提高或达到一定的溶氧水平可改变通入培养罐内气体中氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的目的。采用二氧化碳/碳酸氢钠(C02/NaHC03)缓冲液系统来控制培养液的pH值是一种较好的方法。现在，由于动物细胞培养技术在规模和可靠性方面都不断发展，且从中得到的蛋白质也被证明是安全有效的，因此人们对动物细胞培养的态度已经发生了改变。许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对较大、较复杂或糖基化(glycosylated)的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。60年代初，英国AVRI研宄所在贴壁细胞系BHK21中将口蹄疫病毒培养成功后，从最初的200ml和800ml玻璃容器开始，很快就放大到30L和100L不锈钢罐的培养规模。使用的是基于Eagle’s配方的培养基，补充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后，Wellcome (现为Cooper动物保健)集团分布于欧洲、非洲和南美洲8个国家的生产厂商，应用此项技术工业规模化生产口蹄疫疫苗和兽用狂犬疫苗，已掌握了5000L的细胞罐大规模培养技术。现有的病毒制剂的中试生产工艺有的可操作性和可控性不够强，有的生产成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对现有的病毒制剂的中试生产工艺有的可操作性和可控性不够强，有的生产成本较高之不足，而提供一种稳定、高效的重组单纯疱瘆病毒制剂的中试生产工艺。本专利技术的方法为: 1.本专利技术中所用的微载体为纳米T12，为本实验室制备。2.本专利技术中所用的细胞为Ve1细胞(非洲绿猴肾细胞)。3.微载体的水化和消毒:称一定量的微载体放入容器中，按每克微载体加50?10ml的比例，加入无Ca2 +和Mg2 +的磷酸缓冲液(PBS)，室温下放置应不少于3小时，并不时轻微搅动，然后再用新鲜PBS洗一次。将经水化后的微载体用70%酒精浸泡消毒，再用无菌的PBS漂洗一至二次。 4.采用生物反应器逐级放大培养。5.细胞用T25规格的方瓶进行培养，以1: 3.5进行传代。6.CelliGen生物反应器内的微载体浓度5 g/ L，细胞接种密度1.1 XlO6cells/ ml，控制溶氧为40 %空气饱和度、搅拌速度50 r/ min、温度36值7.0。 7.使用中空纤维滤膜(0.Sum )超滤进行病毒纯化，回收率保持在70%左右。本专利技术的优点:本专利技术工艺由于采用了先进的生物反应器作为细胞孵育系统，并进行了在微载体悬浮条件下培养细胞，先进的工艺保证了高病毒产量和制剂的生物活性和稳定性。本专利技术优点:在本专利技术中，由于采用了第二代生物反应器进行悬浮培养方式等一系列先进和严格的生产工艺，保证了高纯度、高得率和高生物活性的重组单纯疱瘆病毒制剂的获得，为重组疱瘆病毒作为基因治疗载体及临床应用提供了应用前景。可进行大规模生产，满足商品化需求。该专利技术工艺的可操作性和可控性较强。该专利技术工艺充分保证了较高的产品生物活性。生产成本较低。生产效率高效。对环境污染较小。应用本专利技术所制备的单纯重组疱瘆病毒纯度高、病毒产量大。【附图说明】附图1:Vero细胞生长曲线图。【具体实施方式】实施实例I (I)建立重组单纯疱瘆病毒包装细胞种子细胞库及工作细胞库。用高通量细胞筛选仪重组单纯疱瘆病毒种子细胞库中生长速度较快、细胞均一性较好且病毒颗粒产量较高的单克隆Vero细胞。该种子细胞库经三代稳定培养后建成工作细胞库。(2)单克隆重组疱瘆病毒的获取 用空斑形成实验的方法检测病毒滴度，以确保获得当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组单纯疱疹病毒的纯化方法，其特征在该方法包括如下步骤：(I).将在Vero细胞中扩增得到的重组单纯疱疹病毒上清液中加入5%的PEG8000，4oC搅拌6个小时或过夜，4oC 13500g离心2小时；(II).沉淀用TNMC缓冲液溶解，并在溶液中加入n‑十二烷基‑β‑D‑麦芽苷促进沉淀的溶解；(III).制备蔗糖密度梯度，将浓缩的mtHSV溶液加于蔗糖密度梯度顶层，37 500 g 离心力在4oC离心18小时；(IV).将离心管底部刺穿，按一定体积量等体积收集，收集10管，取每管收集液的一部分做蛋白质电泳染色和Western blotting鉴定分析，将经鉴定分析确定了的病毒含量和纯度高的收集管冻存于‑80oC或液氮罐中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘为勇，王涛，
申请(专利权)人：湖北创瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42