本发明专利技术涉及生产流感传染性病毒的方法，其中通过用合适的表达载体集转染细胞生成的传染性流感病毒种子转染CHO细胞。本发明专利技术还涉及重组盒，以及包含所述重组盒的载体，其可用于产生传染性病毒的方法中，且特别是根据本发明专利技术的方法中。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】传染性流感病毒的生产 专利
本专利技术设及用于生产流感传染性病毒的方法，其中用通过使用合适的表达载体集 转染细胞生成的传染性流感病毒种子感染CK)细胞。本专利技术还设及重组盒，W及包含所述 重组盒的载体，其可用于生产感染性病毒的方法，特别是根据本专利技术的方法。[000引专利技术背景 流感病毒是高度传染的呼吸道疾病，通常称为"流感"，的病原体，其可影响动物 和人从而引发健康和经济问题。流感病毒是具有由单链阴性RNA片段组成的分割的基 因组的包膜RNA病毒。流感病毒涵盖=种类型：流感A、流感B和流感C病毒。流感A和 B病毒导致人流感流行病，其每年导致超过50000人死亡（Rossmanetal,2011,Virolo gy，411(2):229-236)。虽然流感A病毒感染人还有多种动物（鸟类、猪、马、狗、猫等），且最 大的天然储存体是野生水鸟，流感B病毒主要限于人，其部分是由于B/NS1蛋白质不能抵消 其他品种的先天免疫应答（Sri化aranetal, 2010,JBiolChem, 285 (11): 7852-7856)，而 流感C病毒分离自人和猪。 A型病毒具有球形或丝形且具有约80至150nm的大小。由脂双层组成的病毒包膜 来自宿主细胞的脂质膜。作为宿主抗体的主要祀，表面糖蛋白HA(血凝素）和NA(神经氨 酸酶）形成的针插入该包膜中。同样包埋于所述膜中的M2蛋白质是主要在病毒的脱壳作 用中发挥功能的离子通道。基质蛋白Ml位于病毒内缘与脂双层和核糖核蛋白（RN巧相关 联。其在RNPs的核质运出过程中具有重要作用。在衣壳中，vRNA片段加工非编码5'和3' 末端，其包含用于病毒基因组转录、复制和壳体化所必需的信号。称为PA(聚合酶酸性）、 PB1 (聚合酶碱性蛋白1)、PB2(聚合酶碱性蛋白2)、NP(核蛋白）、HA、NA、M和NS(非结构 蛋白）的流感A病毒的八种vRNA通过选择性剪接编码一种或多种蛋白质。所述PA片段编 码PA蛋白；所述PB1片段编码PBUPB1-F2和PB1-N40蛋白；所述NP片段编码NP蛋白；所 述HA片段编码HA蛋白；所述NA片段编码NA蛋白；所述M片段编码Ml和M2蛋白；所述NS 片段编码非结构蛋白NS1和NS2或肥P(vRNPs的核输出）。vRNAs盘绕在NP上，NP的每个 单体与24个核巧酸结合，所述聚合酶复合体与RNA分子的两端结合，形成发夹结构。该复 合体由PB1、PB2和PA组成。所述RNA、NP和聚合酶的组合形成核糖核蛋白（RNP)复合体。 [000引 B型病毒具有除NAW外的称为NB的糖蛋白，其如蛋白质M2具有m型结构。 C型病毒仅有一个多功能表面糖蛋白，"血凝素-醋酶-融合蛋白"她巧。 因此，A和B型病毒的基因组包含8种病毒RNA(vRNA)而流感病毒C型的基因组 仅包含7种。[000引流感A病毒根据病毒表面糖蛋白的性质也被分成不同亚型，即，目前的血凝素 (HA)化1至化7)和神经氨酸巧酶（NA) (N1至N9)。 由Burnet在1936年发现的流感病毒能在母鸡含胚卵中生长，该发现 使得流感特性得W研究且允许了失活疫苗的发展值e化aetal，1995,JClin Microbiol, 33 (7): 1948-1949)。如世界卫生组织（WHO)描述，接种疫苗是预防感染最为 有效的方式。幸运的是，已获得安全和有效的疫苗超过70年。季节性流感疫苗包含不同 的流感类型和亚型（A/HINI、A/H3N2和B)，由于抗原修饰其每年更新两次（一次针对南 半球且一次针对北半球）。由于该个原因，WHO协调全球流感监视网络佑ISN)监测流感 病毒的流行病学。一旦包括于下一季的病毒疫苗被确定，候选的高度生长种子病毒株必 须通过WHO合作中屯、如纽约医学院（NYMC，US)、生物标准和控制国立研究院（NIBSC，UK)、 C化小组（Australia)和传染病国立研究院（NIID,Japon)制备（Gerdiletal, 2003 ，Vaccine, 21 (16) : 1776-1779)。疫苗株随后在卵、MDCK或Vero细胞系上由制造商扩增 化oudstaaletal, 2009,Vaccine, 27 (19): 2588-2593)。目前，MDCK(Treeetal, 2001,Vac cine, 19(25-26) :：M44-3450)、Vero(Kistneretal, 1998,Vaccine, 16(9-10) : 960-968)和 PE民.C6?|(Pauetal，2001，Vaccine, 19(17-19) :2716-2721)是全部的S种可能满足监 管需求且已表明成功确保流感A和B病毒得W复制的细胞系。全部的=种细胞系已适应于 在无血清培养基中生长（Coussensetal, 2011，Vaccine, 29(47) :8661-8668)。 将流感病毒引入细胞通过流感血凝素（HA)表面蛋白和特定的细胞表面受体之 间的特异性相互作用发生。特异性针对流感病毒的宿主细胞膜受体由唾液酷乳糖胺链的 糖结构生成（唾液酸a2-3/6半乳糖M-4/3N-己酷氨基葡萄糖）（Suz址i etal，2011，AdvExpMedBiol，705:443-452)。人流感病毒优先与包含Sia2-6Gal连接 的细胞受体结合，其中禽病毒优先与Sia2-3Gal受体结合（Coussensetal,2011,Vacc ine，29(47) :8661-8668)。当两种病毒感染相同细胞时，称为重排的基因组vRNAs的不同 组合可能发生。该特性已被用于流感A疫苗的生产来组合祀循环病毒的HA和神经氨酸 酶（NA)蛋白的抗原特性与对卵适应性病毒有利的生长特性（内部基因），称为A/Puerto Rico/8/34(PR8)(HlNl)。不幸的是，理想的高产量病毒获取的成功难W预测。此外，如果 分离自未经验证的细胞系，一些病毒株不能被监管机构接受作为祖疫苗株，因此不能使用 该些病毒株（Nicolsonetal, 2005,Vaccine, 23(22):2943-2952)。关于流感类型B病 毒，直至最近，并没有识别具有A/PR/8/34化1N1)生长特性的B病毒。因此，可将流行循 环（或季节性）的B病毒直接用于感染母鸡含胚卵并需要数代来改进B疫苗株的产量 (Iwatsuki-Horimotoetal, 2008,VirusRes, 135(1):161-165)。 自1999年，由于使得传染性流感病毒的生成完全来自克隆的病毒cDNA的基 于质粒的反向遗传技术，在速度和安全性方面实现了显著改进（Fodoretal，1999,J Virol, 73 (11) :9679-9682)。基于能够诱导八种vRNAs和至少转录所需的聚合酶蛋白质复 合体和核蛋白（N巧表达的质粒集，建立了不同的系统。所述聚合酶蛋白质复合体和NP也 可分别通过四种额外质粒的转染或通过使用能使得vRNA和mRNA通过RNA聚合酶I(P化 1)和II(P化2)合成的具有双向启动子的质粒来进行表达（Jacksonetal，2011，JGen Virol,92(Ptl):l-17)。转染的质粒总数可从本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生产传染性流感病毒的方法，其中所述方法包括由下列组成的步骤：a)用表达载体集转染细胞来生成传染性流感病毒种子，b)用所述传染性流感病毒种子感染CHO细胞。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：I·勒加斯特洛伊斯，J·麦迪纳，C·莫斯特，
申请(专利权)人：赛诺菲巴斯德，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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