本发明专利技术涉及一种抗流感病毒寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是发现金刚乙胺或者脂肪链修饰靶向抗病毒的宿主靶标程序死亡蛋白5(PDCD5)抗流感病毒病毒(IV)反义寡核苷酸的结构，制备方法和用途。本实验室用化学合成的方法把金刚乙胺或者脂肪链偶联在筛选到的抗流感反义序列上，RS-HPLC发现反义序列的电负性和极性被降低，用荧光素标记的方法在A549细胞上证明了修饰促进了细胞对反义序列的摄取，在A549和MDCK细胞上发现修饰能够提高反义序列的抗甲型流感病毒H1N1、H3N2及金刚乙胺耐药株H3N2所致细胞病变的活性，因此，本发明专利技术涉及到用化学修饰的方法降低核酸类药物极性，提高核酸类药物的生物利用度、降低用药量、提高抗病毒疗效的新型核酸药物改进的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程药物领域及有机合成领域，具体地说是一种靶向程序细胞死 tia 5 (PDCD5, Programmed cell deathprotein 5) ^n^fiJit^^l^ (IV, influenza virus) 感染的寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列药物的新结构、修饰方法及其治疗药物。
技术介绍
流感病毒感染可引起急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。甲型流感威胁最大，且易发生变异，易引起暴发流行。1918年至1920年，著名的"西班牙流感〃在全球范围内造成了 2000万-4000万人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2)所致的〃亚洲流感"、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的"香港流感"、1977年由甲型流感病毒(HlNl)所致的"俄罗斯流感"、1997年以来出现的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)，以及2009年出现的甲型流感病毒(HlNl)感染，都严重威胁了人们健康和正常生活。流感作为急性呼吸道传染病严重威胁着人们的健康，对于儿童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其严重，而且也已成为社会劳动力损失、医疗负担加重乃至社会不安定的主要原因之一。由于流感病毒变异，常规疫苗不能有效预防流感的发生和流行。过去用于治疗流感的两种较低廉的抗病毒药物三环癸胺(amantadine)和金刚乙胺(remantadine)对人体内流感病毒几乎不起作用，且耐药较为普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂(例如达菲和帕纳米韦)虽效果较好，但随着临床广泛应用，耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺乏可靠的方法对流感的发生和流行进行有效的控制，有效的预防和控制流感病毒方法的已成当务之急。因此研究特异性高、毒副作用小的新型抗流感病毒药物对治疗与预防具有重要现实意义。病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必需的细胞机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病毒信号或者阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生的频率。PD⑶5是一种凋亡效应分子，表达广泛，进化保守，具有促进凋亡和促进 Parapotosis的效应，其编码区全长559bp，编码的PDCD5蛋白由125个氨基酸组成，具有促进多种肿瘤细胞凋亡和抑制增殖的效应。流感病毒感染引起细胞病变(cytopathic effect, CPE)和凋亡，因此，抑制PD⑶5可能保护细胞免受病毒伤害。核酸药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特别是近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。目前几乎所有大的国际制药公司均投入巨资进行核酸药物的研发，如诺华和辉瑞公司分别与ISIS和Eyetech公司共同开发的核酸药物Vitravene和Macugen已批准上市，另有几十个正在进行临床研究。反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15 30个核苷酸。 通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡核苷酸作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。反义药物，其能与特定基因杂交，进而在基因水平干扰致病蛋白的产生，具有比传统药物更高的特异性和高效性。但是由于反义寡核苷酸的作用靶点必须定位于胞内，反义核酸只有在进入细胞内才能起到其应有的效果，但它本身是阴离子多聚体，相对分子质量大、极性强、电负性强，这些特性使其难以透过细胞膜的类脂双分子层进入细胞，故反义药物细胞摄取率低。有报道称仅有 2%的反义药物被细胞摄取，因此，细胞摄取是反义药物研发过程中的一大挑战，所以导向入胞是反义药物及其他细胞摄取率的药物研究的一项重要任务。目前提高反义药物细胞摄取量的方法主要有偶联多聚阳离子、与阳离子脂质体形成反义寡核苷酸脂质体复合物、偶联跨膜肽等。这些物质虽然能有效地提高反义药物的细胞摄取量，但由于它们潜在的细胞毒性使其临床应用受到了一定的限制，因此亟待寻找更加合适的靶向修饰分子，提高反义寡核苷酸类化合物的胞内摄取与药效。金刚乙胺是一种人工合成抗病毒药，通过阻止病毒进入宿主细胞，并抑制病毒的复制，从而抑制病毒繁殖，起到抗病毒的效果。虽然目前金刚乙胺是不错的抗流感病毒药物，但流感病毒的抗原漂移使其对金刚乙胺产生了一定的耐药性。本实验室以宿主基因PDCD5为靶点，设计合成了反义核酸药物，并证明了其对流感病毒感染所致细胞病变(cytopathic effect, CPE)有抑制作用，我们命名该序列为 PR0P5，进一步为了提高该序列的抗流感活性，克服PR0P5的细胞摄取率低的缺点，本研究利金刚乙胺或者脂肪链偶联到PR0P5分子上，以期能够借助金刚乙胺的透膜性及靶向性提高PR0P5在细胞中的摄取量，并提高其治疗流感的效用。修饰后对该序列的抗流感活性进行检测，发现该序列的抗流感活性有了很大的提高。用荧光标记的修饰及未修饰序列，流式细胞术检测细胞中的荧光强度，发现经过修饰的序列进入细胞的速度和量都有很大程度的提尚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗流感病毒药物设计的靶向宿主靶标PDCD5阻断流感病毒复制、抑制流感病毒致病的寡核苷酸序列修饰结构，制备方法及其药物。本专利技术的主要内容是利用化学合成方法用脂肪链或金刚乙胺修饰靶向宿主蛋白 PD⑶5抗甲型流感活性较高的ASODN序列PR0P5，提高了其透膜性，并因此提高该序列的抗流感活性。设计了分别在3，、5，修饰脂肪链(P-ZF、ZF-P)或者金刚乙胺(P_JG、JG-P)和在 3’端修饰脂肪链并在5’端修饰金刚乙胺(JG-P-ZF) 5种针对反义寡核苷酸PR0P5的修饰方法，初步筛选结果显示3’端脂肪链修饰(P-JG)抑制病毒Hmi (A/京防/86-1)所致CPE 作用最佳，JG-P和P-zf次之。进而实验结果证明，修饰后的PR0P5序列对H3N2(A/鲁防/9/93)及金刚乙胺耐药株H3N2(A/京防/073103/2009)流感病毒所致CPE抑制IC5tl都降低了 30% 60%，进一步用荧光素(FAM)标记的PR0P5序列及金刚乙胺修饰的PR0P5序列验证了修饰对细胞摄取反义序列的影响，结果表明金刚乙胺修饰在一定程度上提高了细胞对反义序列的摄取，说明修饰都是提高细胞对反义核酸序列摄取的有效修饰手段。根据本专利技术，对新型生物工程药物ASODN可以进行有效的化学修饰。根据本专利技术，P-JG、JG-P, P-ZF, ZF-P, JG-P-ZF能特异性抑制流感病毒的复制，有可能成为治疗及预防流感病毒感染相关疾病的新型生物工程药物。根据本专利技术，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本专利技术包含了 PR0P5硫代修饰、甲基修饰、金刚乙胺本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种脂肪链或金刚乙胺修饰的寡核苷酸的结构、制备方法，及其在制备用于治疗流感病毒感染及其相关疾病的药物中的用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，赵海豹，杨静，张京玉，丁晓然，周喆，钟芝茵，刘娟，鲁丹丹，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11
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