鸡β肌动蛋白基因内含子1的用途制造技术

本发明专利技术公开了鸡β肌动蛋白内含子1或其功能等同体作为增强子元件或表达“热点”序列的用途，用于构建或重组哺乳动物表达载体以便极高地表达重组蛋白。本发明专利技术还公开了一套极强的基因表达载体的组成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及鸡β肌动蛋白基因内含子iantron-1)的用途，其作为哺乳动物基因 表达启动子的5’或3’侧翼区上的基因表达增强子或基因表达“热点”以构建新的哺乳动 物表达载体或重新构建既存的基因表达载体，用于重组蛋白的极高水平的表达和哺乳动物 细胞系的产生，该哺乳动物细胞系生产极高水平的重组蛋白。
技术介绍
重组蛋白可通过首先将编码该重组蛋白的表达载体引入宿主细胞，然后在该宿主 细胞内表达该重组蛋白来制备。传统的宿主细胞包括未被选择用于无血清悬浮培养基中最 佳强劲增长的原始CHO、NSO和293细胞。传统的表达载体可用SV40或CMV基启动子以控 制重组蛋白的表达。常规表达体系中采用的宿主细胞生长相对缓慢，倍增时间约M-36小 时，并且最佳生长细胞浓度为3-切106细胞/ml。为了增大重组蛋白的生产速度并维持高的生产率，本专利技术人发现可优选地使用某 些具有较短倍增时间和较高细胞密度的强劲的宿主细胞。该强劲的细胞系通常是通过筛选 快速和高密度生长的细胞系来选择，或者从基于快速和高密度生长的任何类型的细胞系中 筛选。然而，对于高水平的基因表达来说，用于常规表达载体中的启动子在这些快速和高密 度生长的细胞系中不够强壮。此外，并没有多少载体能普遍地用于大多数类型的细胞系。因此，需要寻找极强的通用的基因表达载体，它们适合用于大部分强劲的快速生 长的宿主细胞，该宿主细胞有较短的倍增时间和高密度生长。已知植物基因5’调控区通常包含高的丰富的GC含量(CpG岛)。植物基因表达常 常是在比哺乳动物表达更高的水平上构建的。或许，在5’调控区带有强DNA结构的高的丰 富的GC含量作为一种通用的机制对所有基因表达起着关键作用。通过基因组DNA序列的 研究和该领域中以往的实验室经验，鉴别出鸡β肌动蛋白基因内含子1(1.006 片段，SEQ ID No 1)中极高的丰富的GC含量。这1006个碱基对序列包含平均74. 8%的GC含量，具 有的130个碱基对片段的最高GC含量90. 8%。通过我们的实验方法，我们还发现该区域有 极强的DNA 二级结构，其通过无法对PCR通读的极困难的测序以及困难的连接反应而被证 实。因此，假设带有强DNA结构的高度富含GC的基因组DNA，通过调控染色质浓缩和核小体 形成，可能持有所有哺乳动物基因表达的高构建水平的秘密，其调控了基因转录。本专利技术基于一个惊人的发现，即高度富含GC的鸡β肌动蛋白基因内含子1作为 5’ -和/或3’ -侧翼基因表达增强子或基因表达“热点”位点的用途，以构建新的哺乳动物 表达载体或修饰既存的载体，用于重组蛋白的高水平表达。令人惊讶地，鸡肌动蛋白基因内 含子1修饰的哺乳动物表达载体在快速生长的CHO细胞系中产生极高的基因表达水平。简单地说，鸡β肌动蛋白基因内含子1(1.006 片段，SEQ ID No 1)被用作增强子元件或表达“热点”序列，并围绕给定的哺乳动物基因启动子构建，如下所示1)对照(肌动蛋白启动子-多位点接头-POlyA(聚A))；2)ρΜΗ1(内含子1-肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA)；3)pMH2(肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA-内含子1)；4)pMH3(内含子1_肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA-内含子1)；5)pMH4(pCMV启动子-内含子1_多位点接头-polyA)；6)pMH5 (pCMV启动子-内含子1_多位点接头-polyA-内含子1)；7)ρΜΗ6 (ρ内含子I-CMV启动子-内含子1_多位点接头-polyA-内含子1)；8)ρΜΗ7 (ρ内含子1-PGK启动子-多位点接头-polyA)；9)ρΜΗ8 (ρ富含GC的片段-肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA)；10)ρΜΗ9 (ρ肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA-富含GC的片段)。专利技术概述本专利技术公开了鸡β肌动蛋白内含子1或其功能等同体作为增强子元件或表达“热 点”序列用于构建极强的哺乳动物表达载体的用途。本专利技术还公开了一套极强的基因表达 载体的组成。附图简要说明附图说明图1 对照质粒，ρ肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA，是天然的基于鸡β肌 动蛋白启动子的表达载体。它是通过用全长鸡β肌动蛋白基因启动子的1.2721Λ XhoI/ HindIII片段(SEQ ID No 2)插入Mll/Hindlll开启的pBR322载体骨架而构成，该骨载 体架上有EcoRI/NotI多位点接头，随后为polyA位点。图2 内含子1修饰的质粒ρΜΗ1(内含子1-肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA) (SEQ ID No:4)，是通过将1.006kb Sall/I^stl衔接子修饰的内含子1插到紧邻肌动蛋白启 动子序列上游的SalIA3StI位点而构成。然后，将0. 331kb间隔片段(无CMV启动子的CMV 增强子)在正义方向上插到内含子1和肌动蛋白启动子之间的I3StI位点。图3 内含子1修饰的质粒pMH2(肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA-内含子1) (SEQ ID No :5)，是通过将I^tl/Hindlll衔接子修饰的1.0061Λ内含子序列插到紧邻polyA 信号序列下游的Pstl/Hind III位点而构成。然后，将0.3311Λ间隔片段(无CMV启动子 的CMV增强子)在正义方向上插到内含子1和肌动蛋白启动子之间的I3StI位点。图4:内含子1修饰的质粒pMH3(内含子1_肌动蛋白启动子-多位点接 头-polyA-内含子1) (SEQ ID No :6)，是通过将包含pMHl (SEQ IDNo 5)的肌动蛋白启动子 的PvuI/NotI片段与包含pMH2 (SEQ ID No :4)的pBR322骨架的PvuI/NotI片段相结合而 构成。图5 :内含子1修饰的质粒pMH4(pCMV启动子-内含子1_多位点接头-polyA) (SEQ ID No 7)，是通过将带有Sall/PstI位点的PCR扩增的0. 82kbCMV启动子序列与 Pstl/Hindll修饰的内含子1片段结合在一起而构成。然后，将它插到Mll/Hindlll开启 的pBR322载体骨架的Mil/Hind III位点，该载体骨架上带有EcoRI/NotI多位点接头，随 后为polyA位点。图6 内含子1修饰的质粒pMH5 (pCMV启动子-内含子1_多位点接头-polyA-内 含子1) (SEQ ID No :8)，是通过将包含pMH4(SEQ ID No 7)的肌动蛋白启动子的PvuI/NotI片段与含有pMH2(SEQ ID No 5)的pBR322骨架的PvuI/NotI片段相结合而构成。图7 内含子1修饰的质粒pMH6(p内含子1_CMV启动子-内含子1_多位点接 头-polyA-内含子1) (SEQ ID No 9)，是通过将Mil修饰的1. 006kb内含子1序列在正义 方向上插到PMH5 (pCMV启动子-内含子1-多位点接头-polyA-内含子1)的CMV启动子上 游的MlI位点而构成。图8 内含子1修饰的质粒pMH7(p内含子1-PGK启动子-多位点接头-polyA) (SEQ ID No 10)，是通过将带有Pstl/HindHI位点的0. 572kb 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于哺乳动物细胞中多肽重组生产的表达载体，其包括（ａ）哺乳动物启动子序列，（ｂ）编码重组多肽的ＤＮＡ序列，（ｃ）ｐｏｌｙＡ位点，以及（ｄ）增强该多肽表达的富含ＧＣ的ＤＮＡ片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2007.01.25 US 60/897,3941.一种用于哺乳动物细胞中多肽重组生产的表达载体，其包括(a)哺乳动物启动子序 列，(b)编码重组多肽的DNA序列，(c)polyA位点，以及(d)增强该多肽表达的富含GC的 DNA片段。2.如权利要求1所述的表达载体，其中富含GC的片段融合到哺乳动物启动子序列的 5’侧翼区。3.如权利要求1所述的表达载体，其中富含GC的片段融合到哺乳动物启动子序列的 3’侧翼区。4.如权利要求1所述的表达载体，其中富含GC的片段融合到哺乳动物表达载体的 PolyA位点的3’侧翼区。5.一种用于多肽的重组生产的方法，包括在表达载体的控制下于高密度细胞生长的条 件下表达哺乳动物细胞中的多肽，所述表达载体包括(a)哺乳动物启动子序列，(b)编码重 组多肽的DNA序列，(c)polyA位点，以及(d)增强该多肽表达的富含GC的DNA片段。6.如权利要求5所述的方法，其中所述表达载体的富含GC的片段融合到哺乳动物启动 子序列的5’侧翼区。7.如权利要求5所述的方法，其中所述表达载体的富含GC的片段融合到哺乳动物启动 子序列的3’侧翼区。8.如权利要求5所述的方法，其中所述富含GC的片段融合到哺乳动物表达载体的 PolyA位点的3’侧翼区。9.一种用于改善基因表达载体的效力的方法，所述方法包括在载体中包含鸡β肌动 蛋白内含子1或其功能等同体。10.如权利要求9所述的方法，其中所述鸡β肌动蛋白内含子1的功能等同体为富含 GC的片段。11.一种用于哺乳动物细胞中多肽重组生产的表达载体，所述载体包括(a)融合到哺 乳动物启动子序列的侧翼区的鸡β肌动蛋白内含子1或其功能等同体，(b)编码重组多肽 的基因序列，(c)polyA位点，(d)鸡β肌动蛋白内含子1或其功能等同体，以及(e)pBR322 载体骨架。12.如权利要求11所述的表达载体，其中对于元件(a)和(d)的功能等同体为富含GC 的DNA片段。13.如权利要求11所述的表达载体，其中所述元件(a)的鸡β肌动蛋白内含子1或功 能等同体融合到哺乳动物启动子序列的5’侧翼区。14.如权利要求11所述的表达载体，其中所述元件(a)的鸡β肌动蛋白内含子1或功 能等同体融合到哺乳动物启动子序列的3’侧翼区或polyA序列的下游。15.如权利要求11所述的表达载体，其中所述元件(a)的鸡β肌动蛋白内含子1或功 能等同体融合到哺乳动物表达载体的PolyA位点的3’侧翼区。16.如权利要求11所述的表达载体，其包含序列SEQID NO :4。17.如权利要求11所述的表达载体，其包含序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：米祖·惠，
申请(专利权)人：安普罗泰恩公司，
类型：发明
国别省市：US