本发明专利技术提供了一种过表达猪共刺激受体4‑1BB载体及其应用。PCR扩增rosa26基因内含子1左右同源臂，4‑1BB调控序列，OCT4特异启动子；将同源左臂、4‑1BB表达框、含LoxP位点的Cre、Neo表达框、同源右臂、负筛选DTA依次连接，得到4‑1BB同源重组载体p4BOCNDR。将该载体与含特异性靶向猪rosa26基因内含子1的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体共转入猪胎儿成纤维细胞中，以阳性细胞为供体细胞，卵母细胞为受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠获得在rosa26基因第一内含子定点整合有4‑1BB基因且自动删除标记基因的转基因猪。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/ Cas9系统进行的4-1BB基因修饰方法以及4-1BB转基因猪的制备方法。
技术介绍
哺乳动物及其它脊椎动物在应对外界各种病原微生物侵袭及排除异物维持自身 平衡的过程中，逐渐形成了强有力的免疫保护屏障。包括体液免疫和细胞免疫。T细胞是 大多数免疫反应的核心。识别特异性抗原后，T细胞被活化、增殖、分化，从而具有效应功能 或辅助作用。初始(NaYve)T细胞的活化需要来自抗原递呈细胞的两种刺激信号。第一种 是TCR/Q33与抗原递呈细胞（Antigenpresentingcells,APCs)表面特异的MHC-抗原肽 复合物结合产生的特异性的抗原刺激信号；第二种是由T细胞表面的共刺激受体分子和抗 原递呈细胞（APCs)表面相应的配体结合产生的非特异性的刺激信号。如果缺失第二种信 号，TCR与抗原肽的识别通常导致T细胞的凋亡或无能状态（Anergy)。 4-1BB存在于初始(Na〗've>CD4+T和CD8+T细胞表面，与APCs表面的4-1BBL配体 结合，为T细胞的存活、增殖与分化提供重要的共刺激信号。研究表明，4-1BB信号途径不仅 能够有效诱导T细胞介导抗肿瘤，控制病毒感染，而且在调节自身免疫性疾病、移植排斥反 应以及炎症反应等方面发挥重要作用。此外，基于小鼠和猪模型发现，4-1BB在体外、体内均 能够刺激T细胞的激活、增殖和效应功能，是潜在的广谱抗病基因。 作为养猪大国，猪病疫情严重制约了养猪企业的扩张与发展。在我国，猪场常发的 传染性疾病，如蓝耳病、猪圆环病毒II型感染、猪流感、猪瘟、猪气喘病、猪大肠杆菌病和猪 附红细胞体病等，给养猪业造成极大的危害。然而，我国猪用疫苗的应用尚存在许多问题， 如副反应较大，免疫效果不理想等。而4-1BB的生物学功能，提示可以通过转基因的手段增 强猪群的抗病能力。CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/ Cas(CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通 过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒。CRISPR/Cas系统 可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高 效。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小 鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂（doublestrand break,DSB),细胞可通过非同源末端连接（non-homologousendjoining,NHEJ)进行修复， 导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核苷酸共 同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。2014年，ScottJG等利用CRISPR/Cas介导的同源 重组在斑马鱼上实现了基因的替换。HuiYang等利用相同的策略一步获得了带有报告基因 的小鼠。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能 研究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种过表达4-1BB基因的同源重组载体及其应用，即通过基 因工程手段增加宿主4-1BB基因的拷贝数，从而降低T细胞活化的阈值，增强T细胞的效应 功能，达到广谱抗病效果。 本专利技术的另一目的是利用CRISPR_Cas9系统介导同源重组4-1BB基因修饰以获得 4-1BB转基因抗病猪。 本专利技术提供的一种4-1BB基因的同源重组载体，通过以下方法制备得到：以目标 生物基因组为模板，PCR扩增左右同源臂，4-1BB表达框，胚胎期特异性调控元件0CT4;将同 源左臂、4-1BB表达框、含LoxP位点的0CT4调控的Cre表达框和Neo表达框、同源右臂、负 筛选DTA依次连接，得到4-1BB同源重组载体。 进一步地，本专利技术提供的4-1BB基因的同源重组载体，其目标生物为猪；通过以下 步骤制备得到： (1)以pd2EYFP-Nl为载体骨架，利用NdeI和KpnI插入猪rosa26基因内含子1的 同源左臂，同时引入EcoRv酶切位点； (2)利用EcoRV和KpnI插入4-1BB表达框； (3)利用EcoRI和NotI将Neo表达框与Cre基因连接起来，再利用NdeI和NotI 将其连在 0CT4 启动子下游，组成LoxP-0CT4-Cre-3'utr-SV40-Ne〇-3'utr-LoxP，利用KpnI 和NotI将上述双框连到含4-1BB的骨架载体上，同时引入AscI酶切位点； (4)利用AscI和PacI插入猪rosa26基因内含子1的同源右臂； (5)利用PacI和NotI插入DTA表达框，构建成p4B0CNDR同源重组载体。 在p4B0CNDR同源重组载体中，4B代表猪共刺激受体分子4-1BB基因；0代表猪早 期胚胎发育转录因子0CT4的特异性启动子；C代表编码重组酶Cre基因；N代表真核细胞常 用的药物筛选标记基因Neo ;D代表负筛选白喉毒素A基因DTA ;R代表插入位点rosa26基 因。 所述同源左臂为猪基因组rosa26位点内含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 1 所示； 所述同源右臂是rosa26位点内含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQIDNO. 2 所示； 所述4-IBB表达框的序列如SEQIDNO. 3所示； 所述Cre表达框的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示，由胚胎期特异性启动子0CT4 调控。Neo为正筛选标记，其核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示；所述DTA为负筛选标记， 如SEQIDNO. 6 所示。 本专利技术的4-1BB基因的同源重组载体，用于PCR扩增猪r〇sa26基因内含子1的同 源左臂的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO. 7-8所示； 用于PCR扩增猪rosa26基因内含子1的同源右臂的引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO. 9-10 所示； 用于PCR扩增4-1BB表达框的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO. 11-12所示； 用于PCR扩增0CT4启动子的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO. 13-14所示； 用于PCR扩增Cre的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO. 15-16所示。 用于PCR扩增Neo的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO. 17-18所示； 用于PCR扩增DTA的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO. 19-20所示。 本专利技术提供了同源重组载体P4B0CNDR在制备抗病转基因猪中的应用。 本专利技术提供了特异性靶向猪rosa26基因内含子1的SgRNA，其DNA序列如SEQID NO. 21所示或如SEQIDNO. 22所示。二者为互补配对的寡聚核苷酸。 本专利技术提供了含有上述SgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。 本专利技术的含有上述CRISPR/Cas9打靶载体，其通过以下方法制备得到，将SEQID NO. 21、22所示的寡聚核苷酸在94°C，5min，再37°C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种4‑1BB基因的同源重组载体，其特征在于，通过以下方法制备得到：以目标生物基因组为模板，PCR扩增左右同源臂，4‑1BB表达框，胚胎期特异性调控元件OCT4；将同源左臂、4‑1BB表达框、含LoxP位点的OCT4调控的Cre表达框和Neo表达框、同源右臂、负筛选DTA依次连接，得到4‑1BB同源重组载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李秋艳，索勋，黄广平，李志远，李向清，刘贤勇，付怡静，王一丁，田秀玲，索静霞，胡丹丹，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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