本发明专利技术公开了一种构建多位点突变重组表达质粒的高效方法，包括如下步骤：将表达质粒pHAT2用双酶切方法采用两种限制性内切酶NcoI和XhoI酶切产生带有粘性末端5’-CATG-3’和5’-AGCT-3’线性片段，回收线性化质粒片段备用；PCR引物设计；进行三轮PCR反应得到突变表达载体；进行连接反应；构建突变表达载体。本发明专利技术具有突变率高、简单易行的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及生物领域，具体设及。
技术介绍
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我 们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是 蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可W 改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋 白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信 大家也非常熟悉：比如野生型的绿色巧光蛋白（wtGF巧是在紫外光激发下能够发出微弱的 绿色巧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范 围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色巧光蛋白，蓝 色巧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结 构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性 或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，W及药物研发、基因治疗等等方面 但是现有的突变技术效率低下，不适于推广。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术基于重叠延伸PGR和双接头PCR方法，提供了一种构建多 位点突变重组表达质粒的高效方法。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为： ，包括如下步骤： S1、将表达质粒PHAT2用双酶切方法采用两种限制性内切酶化〇1和化〇1酶切产 生带有粘性末端5' -CATG-3'和5' -AGCT-3'线性片段，回收线性化质粒片段备用；[000引 S2、PCR引物设计：将Fs和Rs作为目标基因的正向及反向巢氏引物；将T7和SP6 作为表达质粒PHAT2阅读框上下游一对引物；对Fmim2M3和Rm1M2M3引物根据目标基因突变位点 序列进行设计； S3、进行S轮PCR反应得到突变表达载体：第一轮PCR反应，分别用T7/Rmim2M3和 SP6/Fmim2M3两对引物进行扩增，得到含有突变位点基因片段；第二轮PCR反应用Fs和Rs引 物进行扩增，W第一轮PCR反应扩增后回收的含有突变位点基因片段为模板；第S轮PCR反 应分别用Ftl/Rs和化2/Fs两对引物进行扩增，回收产物等量（摩尔数）混合，回收线性化 基因片段备用； S4、进行连接反应：将线性化质粒片段和基因片段进行连接，连接反应的体系 如下：0. 1-0.化 mol(5yL)基因片段，0. 01-0. 0 化 mol(3yL)载体片段，lyLIOXT4DNA ligase BuffeH660mM Tris-HCl pH7. 6,66mM MgClz'lOOmM l，4-Dithiothreitol，lmM ATP)，1y LTJ)NAligase(350U/y L，TaKaRa)16°C 10-12h; S5、构建突变表达载体：将步骤S4所得的连接产物转化40 y L E. coli JM109度iomed)，大肠杆菌悬浮液均匀平铺含有氨节（100 y g血1化B琼脂板上，37°C的溫度 下培养12-1化后，阳性克隆用PCR方法检测验证。[001引其中，所述步骤S2中对Fmim2M3和Rm1M2M3的具体设计为：Fm1M2M35'序列15个碱基 巧雖M乌A9M跑n-3'）是用于拼接反应的，随后的3个碱基（5'-iee-3'）是突变位 点，Fm1M2M33'序列15个碱基是目标基因序列；Rmim2M35'序列依次为互补突变位点（5'-雄A-3') 及15个碱基巧' -M跑n巧GAI雖IG -3'）用于拼接反应，Rm?2M33'序列15个碱基是目 标基因序列。 其中，所述的Ftl和化2引物分别是在巢氏引物Fs和Rs 5'加入粘性末端 5, -CATG-3,和 5, -AGCT-3，。 其中，所述的第一轮PCR反应和第二轮PCR反应的反应体系均为：l-100ng模板 DNA，1 y L 引物 T7/Rmim2M3或者 SP6/FM1M2M3(20 y M)，4 y L dNTP (2. 5mM)，5 y L 10 X Pyrobest buffer II，0. 25]iL of Pyrobest DM Polymerase(5U/]iLTaKaRa)，加 d地2〇 至 50]iL 体 系。 其中，所述的第一轮PCR反应和第二轮PCR反应的反应条件如下：94°C 4min， 94°C 30s，58°C 30s，72°C 40s，25 循环，72°C延伸 lOmin。 其中，所述的第S轮PCR反应的反应体系为：94°C变性10min，65°C复性15min， 16°C 30s〇 本专利技术具有W下有益效果： 本专利技术具有突变率高、简单易行的特点。【附图说明】 图1为本专利技术实施例中S轮PCR反应的反应流程示意图。 图中，M1M2M3代表S个突变位点（A)首轮PCR反应分别用T7/R M1M2M3和SP6/F M1M2M3两 对引物进行扩增；度）第二轮PCR反应用Fs和Rs引物进行扩增；(C)第S轮PCR反应分别 用Ftl/Rs和化2/Fs两对引物进行扩增；值）变复性后的PCR产物会产生4种产物，其中只 有5'含有（5' -CATG-3')粘性末端序列是目标序列。 图2为本专利技术实施例的目标基因序列。 图中，碱基突变为TGC，对应的蛋白质氨基酸由谷氨酷胺（曲突变为半脫氨酸 似 图3为每一轮PGR产物电泳图。 图4为引物T7和Rs检测阳性克隆PCR扩增结果。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，W下结合实施例对本专利技术进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本专利技术，并不用于限定本发 明。 -种构建多位点突变重组表达质粒的高效方法，包括如下步骤： S1、将表达质粒PHAT2用双酶切方法采用两种限制性内切酶化〇1和化〇1酶切产 生带有粘性末端5' -CATG-3'和5' -AGCT-3'线性片段，回收线性化质粒片段备用；[002引 S2、PCR引物设计：如表1所示，将Fs和Rs作为目标基因的正向及反向巢氏引 物；将T7和SP6作为表达质粒PHAT2阅读框上下游一对引物；对Fmim2M3和Rmim2M3引物根据 目标基因突变位点序列进行设计；Fmim2M3和Rm1M2M3的具体设计为：Fm1M2M35'序列15个碱基 巧'-.0^0的自為6心雖11-3'）是用于拼接反应的，随后的3个碱基（5'-1￡￡-3'）是突变位 点，Fm1M2M33'序列15个碱基是目标基因序列；Rmim2M35'序列依次为互补突变位点（5'-雄A-3') 及15个碱基巧'-M祐.nCTGAT货QJG-3'）用于拼接反应，Rmim2M33'序列15个碱基是目标 基当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种构建多位点突变重组表达质粒的高效方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将表达质粒pHAT2用双酶切方法采用两种限制性内切酶Ncol和Xhol酶切产生带有粘性末端5’‑CATG‑3’和5’‑AGCT‑3’线性片段，回收线性化质粒片段备用；S2、PCR引物设计：将Fs和Rs作为目标基因的正向及反向巢氏引物；将T7和SP6作为表达质粒pHAT2阅读框上下游一对引物；对FM1M2M3和RM1M2M3引物根据目标基因突变位点序列进行设计；S3、进行三轮PCR反应得到突变表达载体：第一轮PCR反应，分别用T7/RM1M2M3和SP6/FM1M2M3两对引物进行扩增，得到含有突变位点基因片段；第二轮PCR反应用Fs和Rs引物进行扩增，以第一轮PCR反应扩增后回收的含有突变位点基因片段为模板；第三轮PCR反应分别用Ft1/Rs和Rt2/Fs两对引物进行扩增，回收产物等量混合，回收线性化基因片段备用；S4、进行连接反应：将线性化质粒片段和基因片段进行连接，连接反应的体系如下：0.1‑0.2pmol基因片段，0.01‑0.02pmol载体片段，1μL 10×T4 DNA ligase Buffer，1μL T4 DNA ligase 16℃10‑12h；S5、构建突变表达载体：将步骤S4所得的连接产物转化40μL E.co/i JM109，大肠杆菌悬浮液均匀平铺含有氨苄LB琼脂板上，37℃的温度下培养12‑16h后，阳性克隆用PCR方法检测验证。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄金光，孙晓梅，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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