一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，包括盒体和检测卡，所述的盒体包括样品采集区和结果显示区，所述的检测卡包括底板、吸水滤纸、显色垫和样品垫，所述的显色垫包括检测区和质控区，所述的样品垫包括保护垫和胶体金层，所述的胶体金层是由涂有胶体金颗粒标记的H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜制成，所述检测区包被有H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体，所述质控区包被有兔抗鼠IgG抗体。本发明专利技术的试剂盒，操作简单，特异性好，能在5‑10min内得到检测结果，便于对禽类是否感染H9N2亚型禽流感病毒做出快速诊断，有很好的推广意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物传染性疾病检测器械
，具体是涉及一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒。
技术介绍
根据国家有关实验室统计数据，2012年商品肉鸡感疫病染率最高的依然是H9N2。如果将H9N2与H5加起来，总的感染率是82.21％。这说明每只鸡死亡的原因，有82.21％来源于禽流感。而由其他疾病导致的只占17.79％。在商品肉鸡、肉杂鸡、青年鸡群中，根据国家有关机构资料证明，H9N2流感病毒(AIV)隐性感染率1％。单独感染H9N2之后并没有固定的临床表现症状。通过病毒接种实验，看不到H9N2的任何病变和症状，曾采取肌注等多种方式攻毒后，未发现H9N2有任何的临床表现症状。这说明H9N2并不单独感染，也不致病，只有继发或并发了其他的疾病之后才会表现出一些临床症状。因此，在防控H9N2型禽流感时应将治疗与它一起作怪的疾病同步进行。H9N2流感在冬春季节发病时一般常见的发病形式是流感继发气囊炎形式，病变上主要表现部分鸡肿头肿脸、拉绿色粪便、有呼吸道症状、眼睛流泪、缩头闭眼等。病变主要表现在胰脏边沿出血、胸腺肿胀出血、气管出血、气管下部有出血环、纤维素性肺炎等。如果继发感染后，主要表现腹腔、前胸气囊内出现泡沫等浆液性渗出物，2天后肺脏会出现典型的纤维素性肺炎。出现水肿充血期(水肿充血期)、发红出血(红色肝变期)、肺脏浅灰色肿胀(灰色肝变期)、逐步出血纤维素样坏死(纤维素样肝变期)，部分地区出血结核性肺炎等病变。在中后期各个气囊、腹腔内都会同时出现严重的干酪样渗出物；部分有纤维素样渗出物。就构成所谓的“气囊炎病”或“流感气囊炎病”。目前对于H9N2亚型禽流感病毒的预防首先是增强鸡的抵抗力，可以选用增强免疫的中药方剂进行保健。一般免疫都是选在前三周进行，这三周至少要进行1-2个疗程的保健，如果不保健的话，鸡就极有可能发病，其次针对不同的鸡群合理应用抗生素；此外，在免疫时须再次增强抵抗力，同时对H9N2亚型禽流感病毒的检测也是至关重要，特别对于基层的动物疫控工作者来说，快速的检测出病毒对于及时的防止感染有很关键的作用。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种灵敏度高、使用方便的快速检测H9N2亚 型禽流感病毒的试剂盒。本专利技术的技术方案为：一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，包括盒体和检测卡，所述的盒体包括样品采集区和结果显示区；所述的检测卡镶嵌在盒体中，包括底板、吸水滤纸、显色垫和样品垫，吸水滤纸、显色垫和样品垫依次粘结在底板上；所述的样品垫包括保护垫和胶体金层，保护垫卡在胶体金层上方，所述的胶体金层是由涂有胶体金颗粒标记的H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜制成，所述的显色垫包括检测区和质控区，所述检测区包被有抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体，所述的质控区包被有兔抗鼠IgG抗体。进一步的，所述的底板为合成树脂材料制得，所述的合成树脂为高分子化合物，是由低分子原料氯乙烯通过聚合反应结合成大分子悬浮聚合生产的，悬浮聚合将单体在机械搅拌或振荡和分散剂的作用下，单体分散成液滴，通常悬浮于水中进行的聚合过程，这种方法物料粘度低，容易传热和控制，聚合后只需经过简单的分离、洗涤、干燥等工序，即得树脂产品，产品纯净、均匀；所述的检测区包被有H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体而形成的检测线，所述的质控区包被有兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述的检测线采用抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体浓度为0.3-0.5mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用兔抗鼠IgG抗体浓度为1.0-1.2mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫为医用皂化醋酸纤维素膜，所述的皂化醋酯纤维是用纤维素为原料，经化学法转化成醋酸纤维素酯制成的化学纤维，耐光性较好，伸缩率低，不受待检成分中化学物质的影响。一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒的制备方法为：步骤一、胶体金标记抗原溶液制备：a.将容器用纯化水清洗干净后，加入1wt％氯金酸水溶液加热至100℃，再按3-5％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，反应10-20min，胶体金溶液由完全变成紫色，继续保持100℃加热，胶体金溶液变成紫红色后，停止加热并冷却至25℃，使用碳酸钾溶液调节pH至8.0-9.0，得到胶体金溶液，备用；b.用制备好的PBS缓冲液将H9N2亚型禽流感病毒抗原稀释至蛋白含量为0.5-0.8mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液成分含量为8％BSA，3％蔗糖，0.8％NaCl和0.03％NaN3，再将稀释液在5-8℃条件下2400-3000r/min离心10-20min， 去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，在5-8℃条件下2400-3000r/min离心30-60min，静置8-12h后，即得到胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原；步骤二、样品垫制备：a.将聚乙二醇200 12-15g、聚乙烯吡咯烷酮15-20g、牛血清白蛋白10-15g、屈立通X-1000 1-1.5ml、吐温20 5-8ml混合后用5mM-10mM磷酸盐缓冲液定容至1000ml，调节pH值9.3-9.5得到处理液，将所述的保护垫浸泡于处理液中20-30min，取出于37℃恒温烘干后封存，备用；b.将胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原溶液均匀喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，制得胶体金层，再将胶体金层与保护垫粘结，即制得所述的样品垫。步骤三、显色垫制备：将抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体稀释成浓度为0.3-0.5mg/mL的包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上得到检测线；将兔抗鼠IgG抗体稀释成浓度为1.0-1.2mg/mL包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃恒温干燥3-5h，封存，即得到所述的显色垫；步骤四、试剂盒制备：给底板上粘结显色垫，然后在显色垫的上方粘结吸水滤纸，显色垫与吸水滤纸相互交叠0.2mm，在显色垫的下方粘结样品垫，显色垫和样品垫之间相互交叠0.2mm，按5-8mm的宽度，25-30mm的长度进行切割裁剪，制得检测卡，将检测卡放在塑料壳体中，样品垫与样品采集区对准，显色垫与结果显示区对准，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒。本专利技术试剂盒的使用方法：将待检测鸡血液30μl滴于试剂盒样品采集区的样品垫上，5-10min之内观察色变情况，鸡血液中的红细胞凝集与特异性免疫血清所抑制，若待检样品中含有H9N2亚型禽流感病毒，则与样品垫中的胶体金标记的病毒特异性抗原结合，通过免疫层析作用与硝酸纤维素膜上的抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体结合后，会形成肉眼可见的一条红色检测线，未结合完的胶体金标记的病毒特异性抗原继续层析与和兔抗鼠IgG抗体结合后亦形成肉眼可见的第二条红色质控线；若待检样品中不含H9N2亚型禽流感病毒抗原，则仅出现一条红色质控线；若红色质控线未出现，则该检测试剂盒失效。本专利技术的试剂盒的有益效果体现在：该试剂盒是一种特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作检测试剂盒，利用胶体金免疫层析的原理，能在常温下5-10min内得到检测结果，便于对鸡是否感染H9N2亚型禽流感病毒做出快速本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，包括盒体(1)和检测卡(2)，其特征在于，所述的盒体包括样品采集区(3)和结果显示区(4)；所述的检测卡镶嵌在盒体(1)中，包括底板(5)、吸水滤纸(6)、显色垫(7)和样品垫(8)，吸水滤纸(6)、显色垫(7)和样品垫(8)依次粘结在底板(5)上；所述的样品垫(8)包括保护垫(11)和胶体金层(12)，保护垫(11)卡在胶体金层(12)上方，所述的胶体金层(12)是由涂有胶体金颗粒标记的H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜制成，所述的显色垫(7)包括检测区(9)和质控区(10)，所述检测区(9)包被有抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体，所述的质控区(10)包被有兔抗鼠IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，包括盒体(1)和检测卡(2)，其特征在于，所述的盒体包括样品采集区(3)和结果显示区(4)；所述的检测卡镶嵌在盒体(1)中，包括底板(5)、吸水滤纸(6)、显色垫(7)和样品垫(8)，吸水滤纸(6)、显色垫(7)和样品垫(8)依次粘结在底板(5)上；所述的样品垫(8)包括保护垫(11)和胶体金层(12)，保护垫(11)卡在胶体金层(12)上方，所述的胶体金层(12)是由涂有胶体金颗粒标记的H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜制成，所述的显色垫(7)包括检测区(9)和质控区(10)，所述检测区(9)包被有抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体，所述的质控区(10)包被有兔抗鼠IgG抗体。2.如权利要求1所述的一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述的底板(5)为合成树脂材料制得；所述的检测区(9)包被有H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体而形成的检测线，所述的质控区(10)包被有兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述的检测线采用抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体浓度为0.3-0.5mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用兔抗鼠IgG抗体浓度为1.0-1.2mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫(11)为医用皂化醋酸纤维素膜。3.如权利要求1所述的一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，制备方法为：步骤一、胶体金标记抗原溶液制备：a.将容器用纯化水清洗干净后，加入1wt％氯金酸水溶液加热至100℃，再按3-5％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，反应10-20min，胶体金溶液由完全变成紫色，继续保持100℃加热，胶体金溶液变成紫红色后，停止加热并冷却至25℃，使用碳酸钾溶液调节pH至8.0-9.0，得到胶体金溶液，备用；b.用制备好的PBS缓冲液将H9N2亚型禽流感病毒抗原稀释至蛋白含量为0.5-0.8mg/mL的稀释液，所述的PBS缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱明霞，张敏，孙振涛，裴兰英，李玉保，刘文强，司振书，袁凤英，
申请(专利权)人：聊城大学，
类型：发明
国别省市：山东;37