本发明专利技术涉及一种生物工程产品的结构、制备方法及其用途。具体说是脂肪链修饰的靶向流感病毒非编码区的寡核苷酸的结构、制备方法以及其在制备治疗和预防流感病毒感染相关疾病的药物中的用途。它是根据流感病毒基因组两端保守序列设计的寡核苷酸，其分子式是-O-P＝(O)(Y)-O-，其中Y代表氧，硫和甲基，在合成时经脂肪链修饰。活性评价结果显示该寡核苷酸修饰物及其复合物抑制了流感病毒在细胞内的复制，是治疗流感的新型生物工程类药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程药物领域及有机合成领域，具体地说是一种脂肪链修饰的寡核苷酸的结构、制备方法及防治流感病毒感染的用途。
技术介绍
流感病毒感染可引起急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。甲型流感威胁最大，且易发生变异，易引起暴发流行。1918年至1920年，著名的西班牙流感〃在全球范围内造成了 2000万-4000万人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N》所致的〃亚洲流感、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的香港流感、1977年由甲型流感病毒(HlNl)所致的俄罗斯流感、1997年以来出现的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)，以及2009年出现的甲型流感病毒感染，都严重威胁了人们的健康和正常生活。流感作为急性呼吸道传染病严重威胁着人们的健康，对于儿童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其严重，而且也已成为社会劳动力损失、医疗负担加重乃至社会不安定的主要原因之一。由于流感病毒变异，常规疫苗不能有效预防流感的发生和流行。过去用于治疗流感的两种较低廉的抗病毒药物三环癸胺(amantadine)和金刚乙胺(remantadine)对人体内流感病毒几乎不起作用，且耐药较为普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂(例如达菲和帕纳米韦)虽效果较好，但随着临床广泛应用，耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺乏可靠的方法对流感的发生和流行进行有效的控制，有效的预防和控制流感病毒的方法已成当务之急。因此研究特异性高、毒副作用小的新型抗流感病毒药物对治疗与预防流感病毒感染相关性具有重要现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的根据流感病毒基因组设计并制备脂肪链修饰的寡核苷酸，以此可作为流感病毒感染的治疗药物。本专利技术的主要内容是以流感病毒基因片段5’端保守序列为靶点，设计并合成与5’端互补的硫代寡核苷酸，并通过直接合成的方法在序列的3’端或5’端连入脂肪链(Flu-3-ZF，FLU-5-ZF)，以A型流感病毒代表株Al/京防/86-1 (HlNl)和A3/鲁防 /93-9 (H3N2)、A/Bei jing/073103/2009 (金刚乙胺耐药的H3N》为对象，以流感病毒致细胞病变(CPE)以及流感病毒的复制水平为指标，在A549细胞比较评价了 FLU-3-ZF、FLU-5-ZF 抑制流感病毒复制的作用，结果表明FLU-3-ZF、FLU-5-ZF能剂量依赖性地抑制流感病毒的复制。根据本专利技术，FLU-3-ZF、FLU-5_ZF能特异性抑制流感病毒的复制，有可能成为治疗及预防流感病毒感染相关疾病的新型生物工程药物。根据本专利技术，本专利技术的寡核苷酸修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的制剂。根据本专利技术，本专利技术的寡核苷酸修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其他寡核苷酸及其衍生物形式，还可以含有治疗上可以接受的载体材料，如脂质体、融合肽或病毒载体等。根据本专利技术，本专利技术的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。本专利技术的实施对严重危害人类健康的流感病毒感染的预防和治疗具有重要的社会效益和经济效益。附图说明图 1 FLU-3-ZF，FLU-5-ZF 合成路线2 FLU-3-ZF，FLU_5_ZF剂量依赖性地抑制Hmi型流感病毒致细胞病变作用图3 FLU-3-ZF，FLU-5-ZF剂量依赖性地抑制H3N2型流感病毒致细胞病变作用图4 FLU-3-ZF，FLU-5-ZF剂量依赖性地抑制金刚乙胺耐药株H3N2型流感病毒致细胞病变作用图5 FLU-3-ZF，FLU-5-ZF剂量依赖性地抑制Hmi型流感病毒的复制图6 FLU-3-ZF，FLU-5-ZF剂量依赖性地抑制H3N2型流感病毒的复制具体实施例方式实施例一本实施例主要说明FLU-3-ZF的制备方法，主要技术要点如下(合成路线图见附图 1)a)将二十二酸l(3.40g，10mmol)溶解于有机溶剂中，将氨基醇2 (2. 21g，15mmol) 的溶液加入到其中，加入缩水剂DCC(2. 27g，12mmol)，于0 60°C条件下搅拌1 12小时， 蒸除溶剂后重结晶得浅黄色结晶3. 28g,收率70%。(化合物3)。b)将化合物3 (3. 00g, 6. 39mmol)溶解于有机溶剂中，然后将DMTCl (2. 38g，7.03mmol)加入到反应体系中，于-10 50°C下反应1 3小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的浅黄色蜡状固体3. 35g，收率68%。(化合物4)。c)化合物4(3.00g，3.89mmol)溶解于有机溶剂中，然后将琥珀酸酐(0. 43g， 4. 28mmol)加入到反应体系中，于10 80°C下反应1 4小时，蒸除溶剂重结晶得浅黄色固体2. 59g，收率74%。(化合物5)。d)化合物4(3. 00g, 3. 89mmol)溶解于有机溶剂中，然后将磷酰化试剂(1. 29g, 4. 28mmol)加入到反应体系中，于_10 40°C下惰性气体保护反应0. 5 4小时，蒸除溶剂， 然后萃取，浓缩的白色泡沫状固体2. 34g，收率62% (化合物6)。e)将化合物5的溶液与CPG混合，0 50°C下反应5 40小时，过滤得白色载体8。f)将载体8 (20. OOmg)装入DNA合成仪，合成FLU-3-ZF，然后浓氨水切割，过OPC 柱，HPLC分离纯化。离心抽干。g)将固体6溶解，装入DNA合成仪，合成FLU_5_ZF。反应结束后经浓氨水切割，过OPC柱，HPLC分离纯化。离心抽干。实施例二本实施例主要说明FLU-3-ZF，FLU-5-ZF抗H1N1、H3N2和金刚乙胺耐药的H3N2型流感病毒的活性材料与方法1. A549细胞、病毒和对照药物病毒在10日龄SPF鸡胚传代，收集尿囊液，测定其血凝(Hemagglutination，HA) 效价，取HA价>1 26者，混勻、分装、保存于-70°C备用。使用的病毒毒株为Al/京防 /86-1 (HlNl)、A3/ 鲁防 /93-9 (H3N2)、A/Beijing/073103/2009 (金刚乙胺耐药的 H3N2)。 A549细胞培养液为含10%胎牛血清(Gibco)的Fl^(培养液，病毒感染和细胞病变测定时使用含0. 25%胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的维持液。2.细胞加药A549细胞在含10%胎牛血清(Gibco)的FlI培养基中，于37°C、5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以8000 10000个细胞/孔将细胞接种至96孔细胞培养板中，次日60 80%长满。用含0. 25% FBS的Fl^(稀释FLU-3-ZF、 FLU-5-ZF。以 PBS (pH7. 5)冲洗细胞一次，将 FLU_3-ZF、FLU-5_ZF 以 100 μ 1/ 孔的量加入各孔。同时设立病毒感染阳性对照组和Α549细胞阴性对照组，作用60min。用PBS(pH7.5)冲洗细胞一次，每孔加入 100TCID50/0. Iml 的 A/ 京防 /86-1 (HlNl) ,A3/ 鲁防 /93-9 (H3N2)、A/ Beiji本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种脂肪链修饰的寡核苷酸的结构、制备方法及其在制备用于流感病毒感染及其相关疾病防治的药物中的用途。
【技术特征摘要】
1. 一种脂肪链修饰的寡核苷酸的结构、制备方法及其在制备用于流感病毒感染及其相关疾病防治的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的脂肪链修饰的寡核苷酸，其结构通式选自下列二类结构，3.根据权利要求2所述的寡核苷酸FLUTIDE，其特征是该寡核苷酸经过不同化学修饰。4.根据权利要求3，所述的寡核苷酸FLUTIDE，其化学修饰为硫代修饰。5.根据权利要求1，2，3，4所述的脂肪链修饰的寡核苷酸，可以制成各种不同的剂型， 通过不同的给药途径用于流感病毒感染及其相关性疾病的治疗。6.根据权利要求1，2，3，4，5所述的脂肪链修饰的寡核苷酸，其特征在于，通过如下步骤合成a.将脂肪酸1溶解于有机溶剂中，将氨基醇2的溶液加入到其中，加入缩水剂，于0 60°C条件下搅拌1 12小时，蒸除溶剂后重结晶得浅黄色结晶，得化合物3 ；b.将化合物3溶解于有机溶剂中，然后将DMTCl加入到反应体系中，于-10 50°C下反应1 3小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的浅黄色蜡状固体，为化合物4 ；c.化合物4溶解于有机溶剂中，然后将琥珀酸酐加入到反应体系中，于10 80°C下反应1 4小时，蒸除溶剂重结晶得浅黄色固体，为化合物5 ；d.化合物4溶解于有机溶剂中，然后将磷酰化试剂加入到反应体系中，于-10 40°C 下惰性气体保护反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，杨静，赵海豹，张京玉，丁晓然，鲁丹丹，刘娟，李康，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11
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