获得流感样本中流感病毒核酸的方法及其专用引物技术

本发明专利技术公开了获得流感样本中流感病毒核酸的方法及其专用引物。本发明专利技术所提供的用于扩增流感病毒核酸的引物对，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成。本发明专利技术所提供的获得流感病毒基因组DNA的方法，包括以下步骤：以感染流感病毒的样本的总RNA为模板，用所述引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物，即得到所述流感病毒的核酸。通过本专利的方法，不用进行病毒分离工作直接从临床样本的核酸提取物中扩增流感病毒的基因组，大大简化流感病毒基因研究的程序、节省实验成本。基于本方法，通过设计流感病毒的片段扩增引物，能够直接成功扩增出流感病毒的所有片段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中获得流感样本中流感病毒核酸的方法及其专用引物。
技术介绍
在历史上有很多种瘟疫给人类带来大量死亡和深重灾难。近百年来，由于医学科学的发展和进步，大多数瘟疫得到了控制，唯独流感，人类还没有找到制服它的有效途径和方法。流感病毒属于正黏病毒科，有甲型、乙型与丙型流感病毒三个属。流感病毒因其具有较强的传染性，被认为是影响公共卫生安全的重要危险因素，其中以甲型流感危害最为严重。特别是2009年3月于墨西哥发现、并在世界范围内引起广泛传播的新甲型流感病毒 (swine H1N1)的暴发流行，更加重了人们对于流感病毒传播的担忧。流感由于其不断变异而造成周期性流行，其中变异最为明显的就是甲型流感病毒。该病毒抗原变异后，传染性大，传播迅速，易发生大范围流行。因此，研究病毒抗原性、 致病性和耐药性变异，分析新型流感流行病学规律、临床特征、追踪严重程度变化，科学评估流感大流行风险，对全球依法科学规范有序地防控流感大流行具有重要意义。为了及时了解流感病毒的流行和变异情况，开展以实验室监测是必要的手段。但是，在实验室进行流感监测中，如果采用细胞进行病毒分离的方法进行实验室监测，不但周期长而且对新发生的流感变异株需要更高的实验条件。这些因素造成了流感病毒分离的周期增加。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于扩增流感病毒核酸的引物对。本专利技术所提供的用于扩增流感病毒核酸的引物对，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成。所述流感病毒为甲型流感病毒。所述甲型流感病毒为甲型H3N2亚型流感病毒。本专利技术的另一个目的是提供获得流感病毒核酸的方法。本专利技术所提供的获得流感病毒核酸的方法，包括以下步骤以感染流感病毒的样本的总RNA为模板，用所述引物对进行RT-PCR扩增，得到 RT-PCR扩增产物，即得到所述流感病毒的核酸。所述流感病毒为甲型流感病毒。所述甲型流感病毒为甲型H3N2亚型流感病毒。所述样本为临床流感样病例的咽拭子。所述RT-PCR扩增的反应条件如下42°C 60分钟；94°C预变性2分钟；然后按照下列参数进行5次循环94°C变性30秒，45°C复性30秒，68°C延伸3分钟；再按照下列参数进行35次循环94°C变性30秒，57°C复性30秒，72°C延伸3分钟；循环反应结束后在68°C保持7分钟。所述获得流感病毒核酸的方法在制备流感疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述获得流感病毒核酸的方法在筛选预防和/或治疗流感的药物中的应用也属于本专利技术的保护范围。通过本专利的方法，不用进行病毒分离工作直接从临床样本的核酸提取物中扩增流感病毒的基因组，大大简化流感病毒基因研究的程序、节省实验成本。基于本方法，通过设计流感病毒的片段扩增引物，能够直接成功扩增出流感病毒的所有片段。附图说明图1为临床样品(具体为咽拭子)中流感病毒核酸的RT-PCR扩增结果。 具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、扩增甲型H3N2亚型流感病毒核酸实验设备和仪器0. 2ml PCR反应管或96孔或384孔反应板；20 μ 1和200 μ 1可调节移液器及滤芯枪头；无菌、无核酸酶的1. 5ml微量离心管；一次性无粉手套；微量离心机或反应板离心机；漩涡振荡器；PCR仪(ABI 9700PCR仪)。工作准备工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如用5%的漂白剂、DNAzap 或者RNase AWAY 来减小核酸交叉污染的风险。1、样本采集取临床上已初步确认为感染甲型H3N2亚型流感病毒的流感样病例的咽拭子进行实验，临床样本的获得均经过患者同意。以甲型H3N2亚型流感疫苗株A/ Perth/16/2009(H3N2)(购自中国疾病预防控制中心)为阳性对照。阳性对照的病毒核酸为已知的，其基因组序列为 Genbank number GQ902806. 1 (PB2)、FJ913004. 1 (PBl)、 CY044513. 1 (PA)、FJ912976. 1 (HA)、CY038866 (NP)、HQ615653. 1 (NA)、CY080548. 1 (M)和 GU907116. 11 (NS)。2、样本总RNA的提取样本处理应在生物安全二级实验室完成。本专利使用核酸提取试剂盒^lIAamp MinElute Virus Spin Kit，货号57704)提取。提取过程参考试剂盒说明书进行。取200ul步骤1所采集的临床样本，加入含有200ulAL 裂解液、25ul蛋白酶K和6. 2ul Carrier RNA的EP管中，混勻后56°C孵育15min ；取出后简单离心，加入250ul无水乙醇，混勻后室温放置5min ；转移液体进入离心柱，6000g离心 Imin ；取出离心柱后于干净离心管，加入500ulAWl洗液，6000g离心Imin ；再次取出离心柱后于干净离心管，加入500ulAW2洗液，6000g离心Imin ；取出离心柱后于干净离心管，加入 500ul无水乙醇，6000g离心Imin ；更换离心管后，20000g离心;3min。将离心柱转移到新的核酸收集管，加入60ul AVE洗脱液或DEPC水(洗脱液的用量一般为20_150ul)，20000g离心lmin。离心后液体即为样本总RNA溶液。43、RT-PCR 扩增过程本专利采用一步法试剂盒(SuperScript HI One-Step RT-PCR System with Platinum iTaq DNA Polymerase，货号12574-026)进行 RT-PCR 片段扩增。具体方法如下PCR扩增的引物序列如下IFA-U-F :AGCRAAAGCAGG (序列表中序列 9)，IFA-U-R :AGTAGAAACAAGG (序列表中序列 10)。RT-PCR扩增的体系为25ul 体系用量(ul)水5.5IOuMPrimers上0.5IOuMPrimers下0.52 X buffer12.5Super Script III1RNA5总体积25RT-PCR扩增的反应程序如下42V 60分钟；94°C预变性2分钟；然后按照下列参数进行5次循环94°C变性30 秒，45°C复性30秒，68°C延伸3分钟；再按照下列参数进行35次循环94°C变性30秒，57°C 复性30秒，72°C延伸3分钟；循环反应结束后在68°C保持7分钟。4、结果对RT-PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。图1中，泳道3 为DNA Maker，泳道1为阳性对照株的扩增结果，泳道2为提取临床样本(咽拭子)核酸使用本专利方法扩增获得的结果。各扩增片段分别为PB2 (2. 3kp)、PBl (2. 3kp)、PA (2. 2kp)、 HA(1. 8kp)、ΝΡ(1· 6kp)、ΝΑ(1· 4kp)、Μ(1· Okp)、NS (0. 9kp)。回收PCR产物进行测序，图1所示的每个扩增片段的测序结果分别为PB2的核苷酸序列如序列表中序列1所示；PBl的核苷酸序列如序列表中序列2所示；PA的核苷酸序列如序列表中序列3所示；HA的核苷酸序列如序列表中序本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于扩增流感病毒核酸的引物对，由序列表中序列９所示的引物和序列表中序列１０所示的引物组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增流感病毒核酸的引物对，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于所述流感病毒为甲型流感病毒。3.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于所述甲型流感病毒为甲型H3N2亚型流感病毒。4.获得流感病毒核酸的方法，包括以下步骤以感染流感病毒的样本的总RNA为模板，用权利要求1-3中任一所述引物对进行 RT-PCR扩增，得到RT-PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹务春，刘玮，魏茂提，张磊，辛忠涛，张小爱，黎浩，马麦卷，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11