本发明专利技术公开了一种A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用。本发明专利技术首先保护一种重组病毒，命名为病毒WSN‑Y385F，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白的第385位酪氨酸残基的密码子突变为苯丙氨酸残基的密码子得到的重组病毒。病毒WSN‑Y385F为温度敏感型病毒，在37℃可以正常复制并存活，在33℃不能正常复制并且不能存活。本发明专利技术还保护一种抑制A型流感病毒的NP蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流感病毒的NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸。本发明专利技术对于流感病毒侵染的机理分析，流感病毒的防治等具有重大价值。
【技术实现步骤摘要】
A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用
本专利技术涉及一种A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用。
技术介绍
A型流感病毒包含8个分节段的RNA片段，利用这些RNA片段，共能编码14种病毒蛋白。而病毒基因组的复制和转录需要由RNP复合物这一功能单元来完成。病毒感染宿主细胞面临着2层屏障，4次穿梭。第一个屏障是病毒进入细胞需要穿过细胞质膜，这时病毒利用血凝素蛋白HA和细胞表面的唾液酸受体结合，进行发生内吞作用入侵到宿主细胞内部。之后基质蛋白M1会释放vRNP复合物到细胞质中，而由于基因组复制和转录需要在细胞核内进行，此时的vRNP复合物面临的第二道屏障，即细胞核膜。vRNP会利用NP蛋白N端的非典型双向NLS同细胞核运输受体蛋白importin-α结合，从而得以穿过核孔复合物，进入到细胞核内部开始复制和转录。转录产生的mRNA在细胞质得到翻译，新合成的病毒聚合酶组分又会分别利用自身的NLS进入到细胞核重新组装成RNP复合物。待病毒基因组复制完毕后，RNP复合物会利用NP蛋白同M1蛋白和NEP蛋白形成一个大的复合物，再利用细胞质运输蛋白CRM1蛋白将之运输到细胞质中，完成再一次的穿梭屏障，然后组装成完整的病毒粒子。NP蛋白在两次穿梭核膜的过程中，发挥着重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用。本专利技术首先保护一种重组病毒，命名为病毒WSN-Y385F，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白的第385位酪氨酸残基的密码子突变为苯丙氨酸残基的密码子得到的重组病毒。病毒WSN-Y385F为温度敏感型病毒，在37℃可以正常复制并存活，在33℃不能正常复制并且不能存活。所述A型流感病毒具体可为WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。所述NP蛋白如序列表的序列1所示。本专利技术还保护一种蛋白质，命名为蛋白质NP-Y385F，是NP蛋白的第385位酪氨酸残基突变为苯丙氨酸残基得到的蛋白质。所述NP蛋白如序列表的序列1所示。编码蛋白质NP-Y385F的基因也属于本专利技术的保护范围。编码蛋白质NP-Y385F的基因命名为基因NP-Y385F。基因NP-Y385F具体可为如下(a)或(b)：(a)编码区如序列表的序列10自5’末端第26-1522位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列10所示的DNA分子。含有基因NP-Y385F的重组质粒也属于本专利技术的保护范围。含有基因NP-Y385F的重组质粒具体可为重组质粒pHH21-NP-Y385F。重组质粒pHH21-NP-Y385F为：在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入基因NP-Y385F得到的重组质粒。含有基因NP-Y385F的重组质粒具体可为重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F。重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F为：在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入基因NP-Y385F得到的重组质粒。本专利技术还保护一种温度敏感型重组病毒，其制备方法包括如下步骤：将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2、重组质粒pHH21-NP-Y385F和重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F共转染离体哺乳动物细胞后进行培养得到的重组病毒；所述质粒pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-PB2具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-HA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-NA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-M为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-NS为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列9所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pcDNA3.0-PA为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的质粒；所述重组质粒pHH21-NP-Y385F为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入基因NP-Y385F得到的质粒；所述重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入基因NP-Y385F得到的质粒。所述哺乳动物细胞具体可为HEK293T/17细胞。所述培养的条件具体可为37℃培养6-78小时。本专利技术还保护一种抑制A型流感病毒的NP蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流感病毒的NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸。本专利技术还保护一种降低A型流感病毒的NP蛋白磷酸化水平的方法，是将A型流感病毒的NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸。本专利技术还保护一种抑制A型流感病毒的NP蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基的密码子由酪氨酸密码子突变为苯丙氨酸密码子。本专利技术还保护一种降低A型流感病毒的NP蛋白磷酸化水平的方法，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基的密码子由酪氨酸密码子突变为苯丙氨酸密码子。所述NP蛋白如序列表的序列1所示。所述A型流感病毒具体可为WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。本专利技术还保护以上任一所述重组病毒在制备A型流感病毒疫苗中的应用。本专利技术还保护一种A型流感病毒疫苗，其活性成分为以上任一所述重组病毒。本专利技术对于流感病毒侵染的机理分析，流感病毒的防治等具有重大价值。附图说明图1为实施例1的步骤一的结果。图2为实施例1的步骤二的结果。图3为实施例2的结果。图4为实施例3的结果。图5为实施例4的结果。图6为实施例5的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组病毒，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白的第385位酪氨酸残基的密码子突变为苯丙氨酸残基的密码子得到的重组病毒。
【技术特征摘要】
1.一种重组病毒，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白的第385位酪氨酸残基的密码子突变为苯丙氨酸残基的密码子得到的重组病毒。2.如权利要求1所述的重组病毒，其特征在于：所述NP蛋白如序列表的序列1所示。3.一种蛋白质，是将NP蛋白的第385位酪氨酸残基突变为苯丙氨酸残基得到的蛋白质。4.编码权利要求3所述蛋白质的基因。5.含有权利要求4所述基因的重组质粒。6.一种重组病毒，其制备方法包括如下步骤：将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2、重组质粒pHH21-NP-Y385F和重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F共转染离体哺乳动物细胞后进行培养得到的重组病毒；所述质粒pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-PB2具体可为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-HA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-NA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文军，郑伟楠，李晶，范文辉，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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