猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种猪伪狂犬病毒(PRV)变异株ZJ01的TK/gE/gI基因缺失毒株及其应用，所述毒株为PRV ZJ01毒株的TK/gE/gI基因缺失毒株ZJ01ΔTK/gE/gI(简称ZJ01R)，体外传代试验结果显示，重组病毒ZJ01R和PRV ZJ01毒株的gE/gI基因缺失毒株ZJ01ΔgE/gI与亲本病毒ZJ01产生的细胞病变一致，病毒滴度与ZJ01毒株相仿；重组病毒ZJ01R目的基因缺失区持续稳定存在，没有出现回复性突变，猪体免疫及攻毒保护试验表明，重组病毒ZJ01R免疫后，猪体无临床症状及病理变化产生，免疫21天后即可产生较高水平的PRV中和抗体，能够抵御致死性PRV变异毒株ZJ01的攻击感染。

【技术实现步骤摘要】
猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用
：本专利技术涉及一种用于制备疫苗的猪伪狂犬病毒变异毒株，特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异毒株TK、gE和gI基因缺失的毒株。
技术介绍
：猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种猪的重要传染病，主要临床症状包括：新生仔猪中枢神经系统紊乱、断奶仔猪和育肥猪表现出呼吸道症状、妊娠母猪繁殖障碍，已经给世界生猪养殖业造成巨大经济损失[1-3]。目前，该病防控主要依靠疫苗免疫，美国与部分欧洲国家已宣布通过基因缺失疫苗免疫和净化技术，根除了该病在家猪中的流行[4]。近30年来，我国广泛使用PRV基因缺失弱毒疫苗，该病得到有效控制并逐步净化[5-6]。但是，2011年以来，我国许多免疫PRV活疫苗的猪场再次暴发该病，主要表现为仔猪神经症状及死亡，生长猪呼吸道症状，妊娠母猪流产、死胎、弱仔等，对该病防控提出新挑战。gE基因在PRV入侵宿主神经系统(包括三叉神经节和嗅神经)的扩散发挥重要作用，是PRV主要毒力基因，同时也是病毒复制的非必须基因。gE与gI是以非共价键形式结合成gE/gI复合物。最新研究表明gE/gI复合物与病毒顺轴突传播相关。gE/gI基因的缺失并不影响病毒的增殖滴度。敲除PRVTK和gE会导致一些PRV毒株毒力的显著下降，并可用于研制PRV弱毒活疫苗。本专利技术选择一种PRV变异强毒株ZJ01，成功构建ZJ01株的感染性细菌人工染色体克隆，并获得TK、gE和gI基因缺失毒株ZJ01ΔTK/gE/gI(简称ZJ01R)和ZJ01ΔgE/gI。体外连续传代培养试验证明，该两个重组病毒的滴度和遗传特性稳定。仔猪接种该病毒后体温平稳，无组织损伤，接种7日后即产生较高的gB抗体，21日时能够产生较高的中和抗体。以大剂量变异强毒株进行攻毒，对照组全部死亡，重组病毒ZJ01R免疫组猪不发生死亡，无体温升高和组织病变，肺脏及脑组织中未检测到病毒，证明该重组病毒对猪体具有良好的免疫保护效果，且对猪体不产生病理损伤，是理想的基因缺失疫苗候选对象，为研制PRV新型疫苗奠定了重要基础。
技术实现思路
：本专利技术提供一种猪伪狂犬病毒变异株TK/gE/gI基因缺失毒株，其保藏编号为：CGMCCNo.10397，分类命名：猪伪狂犬病毒，PRV-ZJ01R。本专利技术所述的毒株，结构为ZJ01TK-/gE-/gI-。本专利技术所述的毒株，其中，ZJ01TK-/gE-/gI-的DNA序列为将ZJ01序列去除序列表1-2的序列所述序列后所得序列。本专利技术所述的毒株，其中，ZJ01的GeneBankDNA序列号为KM061380.1。本专利技术所述的毒株，其中，TK的DNA序列为序列表1的序列。本专利技术所述的毒株，其中，gE的DNA序列为序列表2的序列。本专利技术所述的毒株，其中，gI的DNA序列为序列表2的序列。序列表2的序列为gE/gI基因序列融合在一起的序列。本专利技术所述的毒株，以PRVZJ01株为原始毒株经过基因结构改造得到，其中PRVZJ01株由本实验室于2012年2月分离自浙江某规模猪场发病仔猪，属高致病性毒株，为BHK-21细胞F8代适应毒。本专利技术以PRVZJ01毒株为亲本构建的毒株为TK、gE和gI基因缺失病毒，为BHK-21细胞F10代适应毒。本专利技术的毒株已经保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCCNo.10397，保藏日期2015年02月3日，分类命名：猪伪狂犬病毒，PRV-ZJ01R，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术的病毒毒株，其制备方法的设计方案为：使用含有PRV变异强毒株ZJ01的US7和US8(gE/I)及UL23(TK)基因序列的PCR引物，从pHA2质粒DNA扩增获得含携带细菌人工染色体(BAC)载体和gfp表达盒的基因片段，构建转移载体pHA2-pUC19-BAC-H1-H2和pHA2-pUC19-UL23-H1-H2。先将pHA2-pUC19-BAC-H1-H2与ZJ01毒株全基因组共转染BHK-21细胞，通过同源重组，获得重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI。提取该重组病毒基因组DNA，转化至大肠杆菌宿主菌DH10B，筛选获得含有mini-F序列的PRV感染性BAC克隆(pZJ01)。将pZJ01转染BHK-21细胞可以重新启动病毒的生产性感染。该质粒与pUC19-BAC-H1-H2或gE/gI基因片段全长共转染BHK-21细胞，通过同源重组删除mini-F序列，构建获得gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI。按上述相同方法，将pHA2-pUC19-UL23-H1-H2与ZJ01ΔgE/gI重组病毒全基因组DNA共转染BHK-21细胞，通过同源重组，获得重组病毒ZJ01-GFPΔTK/gE/gI，然后删除mini-F序列，构建获得TK/gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔTK/gE/gI(简称ZJ01R)。体外传代试验结果显示，本专利技术的病毒毒株ZJ01R和ZJ01ΔgE/gI产生的细胞病变与亲本病毒ZJ01一致，病毒滴度与ZJ01毒株相仿；重组病毒目的基因缺失区持续稳定存在，没有出现回复性突变。猪体免疫及攻毒保护试验表明，重组病毒ZJ01R免疫后，猪体无临床症状及病理变化产生，免疫21天后即可产生较高水平的PRV中和抗体，能够抵御致死性PRV变异毒株PVR-ZJ01的感染。附图说明：图1pHA2质粒经同源重组插入PRVZJ01病毒基因组示意图(A)PRVZJ01基因组示意图(大小约为140Kbp)及US7与US8所在区域(B)转移载体构建示意图(C)重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI基因组构成的示意图图2pUC19-BAC-H1-H2的构建与鉴定(A)同源重组臂BAC-H1与BAC-H2基因片段扩增产物((泳道1和2分别为BAC-H1与BAC-H2基因)；(B)pUC19-BAC-H1重组质粒酶切鉴定(泳道1，泳道2为PCR产物对照)；(C)pUC19-BAC-H1-H2重组质粒PacI线性化DNA。泳道M：DSTM5000标准分子量。图3重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI的噬斑纯化与鉴定图3(A)荧光显微镜下的噬斑(上图ZJ01-GFPΔgE/gI拯救病毒、下图细胞对照)。(B)病毒PCR鉴定产物电泳图.泳道1-3：PRV-gE-632-for/rev引物PCR扩增产物；泳道4-6：PRV-HOMO1-for/rev引物PCR扩增产物；泳道1、4：ZJ01；泳道2、5：ZJ01ΔgE/gI；泳道3、6：ZJ01gE/gI-R毒株；泳道M：DSTM5000bp标准分子量。图4PRVZJ01BΔC克隆的遗传稳定性鉴定(A)BAC质粒拯救病毒DNA的BamHI酶切图谱(1：F1代病毒、2：F20代质粒拯救出的病毒，M：DSTM2000bpmarker.)。(B)BAC克隆质粒PCR鉴定(1、2、3泳道分别为F5、F10和F20代质粒，M：1KbDNALadderMarker。(C)拯救病毒荧光空斑(左：F1病毒，右：F20病毒)。图5转移载体转染BHK-21细胞后荧光的鉴定图6重组病毒PRVZJ01ΔTK/gE/gI的纯化与鉴定（A）重组病毒鉴定：病毒接种细胞后进行免疫荧光试验显示PRV特异性荧光，（B）重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪伪狂犬病毒变异强毒株TK/gE/gI基因缺失毒株，其特征在于，保藏编号为：CGMCC No.10397。

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒变异强毒株TK/gE/gI基因缺失毒株，其特征在于，保藏编号为：CGMCCNo.10397。2.根据权利要求1所述的毒株，其特征为2012年于临床发病猪分离到的高毒力猪伪狂犬病病毒，其中，ZJ01的GeneBankDNA序列号为KM061380.1。3.根据权利要求1所述的毒株，其特征为以ZJ01病毒基因组为基础，敲除其TK、gE、gI基因后所得的人工致弱毒株，结构为ZJ01TK-/gE-/gI-。4.根据权利要求1所述的毒株，其特征为以ZJ01病毒基因组为基础，敲除其TK、gE和gI基因后所得的人工致弱毒株，其中，ZJ01TK-/gE-/gI-的DNA序列为将ZJ01序列去除本权利要求书中第5、6、7条所述序列后所得序列。5.根据权利要求1所述的毒株，其中，TK的DNA序列为序列表1的序列。6.根据权利要求1所述的毒株，其中，gE的DNA序列见序列表2的序列。7.根据权利要求1所述的毒株，其中，gI的DNA序列见序列表2的序列。8.权利要求1所述的毒株的制备方法，其特征在于，步骤如下：使用含有PRV强毒株ZJ01的US7和US8(gE/I)及UL23(TK)基因序列的PCR引物，从pHA2质粒DNA扩增获得含携带细菌人工染色体(BAC)载体和gfp表达盒的基因片段，构建转移载体pHA2-pUC19-BAC-H1-H2和pHA2-pUC19-UL23-H1-H2，将pHA2-pUC19-BAC-H1-H2与ZJ01毒株全基因组共转染BHK-21细胞，通过同源重组，获得重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI，提取该重组病毒基因组DNA，转化至大肠杆菌宿主菌DH10B，筛选获得含有mini-F序列的PRV感染性BAC克隆(pZJ01)。将pZJ01转染BHK-21细胞可以重新启动病毒的生产性感染。该pZJ01质粒与pUC19-BAC-H1-H2或gE/gI基因片段全长共转染BHK-21细胞，通过同源重组删除mini-F序列，构建获得gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI。将pHA2-pUC19-UL23-H1-H2与ZJ01ΔgE/gI重组病毒全基因组DNA共转染BHK-21细胞，通过同源重组，获得重组病毒ZJ01-GFPΔTK/gE/gI，然后删除mini-F序列，构建获得TK、gE和gI基因缺失病毒ZJ01ΔTK/gE/gI。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：病毒纯化与基因组提取：取PRVZJ01F5代病毒液，提取PRVZJ01基因组DNA。转移载体的构建：在US6与US9位置设计两对引物PRVBACH1F/R与PRVBACH2F/R，引物序列为：序列3，PRVBACH1F：ATTGAATTCGTACCCGTACACCGAGTCGT；序列4，PRVBACH1R：ACTGAGCTCGGTTAATTAATCATCATCGACGCCGGTACT；序列5，PRVBACH2F：CAACTGCAGCGTTAATTAAGCCGACATGGACACGTTCGA；序列6，PRVBACH2R：TCGAAGCTTTTGTGGACCCGCGAACAT；序列7，PRV-gE-632-for：TCCACTCGCAGCTCTTCT；序列8，PRV-gE-632-rev：GCACGTCATCACGAAGGA；用PRVZJ01基因组DNA作为模板，扩增同源重组臂BAC-H1与BAC-H2。提取重组H1与H2质粒分别用EcoRI/SacI与PstI/...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜平，董静，顾真庆，白娟，王先炜，李玉峰，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32