一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用制造技术

一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用，属于动物检验检疫领域。本发明专利技术提供的检测伪狂犬病毒的核酸组合包括引物对和探针，其碱基序列如SEQ ID NO.1‑3所示，该核酸组合能特异的识别伪狂犬病毒的特异序列，具有较好的特异性；而由于探针的应用，使检测具有更高的灵敏度；在制备检测伪狂犬病毒的试剂盒，应用上述核酸组合，使检测伪狂犬病毒更为快速准确，具有更高的特异性和灵敏度，而且更有利于临床推广和使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物检验检疫领域，且特别涉及一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用。
技术介绍
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是一种对畜牧业危害极大的传染病，由伪狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PRV)引起，可感染多种家畜及野生动物，临床上主要表现为发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍和脑脊髓炎，具有传播范围广、传播途径多、发病快、死亡率高、病原体顽固等特点。目前该病已呈世界性分布，而且流行愈来愈严重，给全球养猪业造成巨大的经济损失。因此建立一种能够快速、敏感和特异的检测PRV的方法对该病的控制至关重要。PRV的检测方法目前主要有动物接种、病毒的分离与鉴定、血清学检测方法和分子生物学检测方法。前三种方法虽然具有特异性和敏感性，但对技术条件要求高，操作比较繁琐，检测周期长，因此不利于病毒的快速检测。分子生物学检测方法，检测的是核酸，是敏感性最高的一种检测方法，以其检测快度、灵敏度高、特异性好等特点被广泛应用于临床检测。分子生物学检测方法主要包括常规PCR法和实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)。传统PCR方法虽然检测简单、快速、方便但存在灵敏度和特异性不够。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，引物组合包含引物对和探针，引物对和探针能特异的结合到目标条带，灵敏度也比较高；而且通过探针标记的显色基团能快速反应出检测结果。本专利技术的第二目的在于提供上述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用。本专利技术的第三目的在于提供上述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在制备检测伪狂犬病毒试剂盒中的应用。本专利技术的第四目的在于提供一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述核酸组合，组成简单，适用于快速检测伪狂犬病毒，而且成本低廉，便于应用和推广。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，核酸组合包括引物对和探针，引物对的碱基序列如SEQIDNO.1-2所示，探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，探针的5’端标记第一显色基团和探针的3’端标记有第二显色基团。第一显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；第二显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；第一显色基团不同于第二显色基团。上述核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用。上述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在制备检测伪狂犬病毒试剂盒中的应用。一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，包括上述的核酸组合。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：针对伪狂犬病毒特异序列设计的核酸组合包括引物对及探针，具有很高的特异性，因此在样本量较低的情况下，也能检测到样本，所以该核酸组合具有很高的灵敏度；能准确的检测到伪狂犬病毒；检测伪狂犬病毒的试剂盒，包含上述核酸组合，由于上述核酸组合的应用，使检测更为方便快捷，结果更为准确，而且试剂盒成本低廉，具有更广泛的应用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例4提供的探针浓度实验结果图；图2为本专利技术实施例5提供的试剂盒特异性检测结果图；图3为本专利技术实验例1提供的试剂盒特异性检测结果图；图4为本专利技术实验例2提供的试剂盒灵敏度检测结果图；图5为本专利技术实验例2提供的PCR产物电泳结果图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用进行具体说明。本专利技术利用Taq酶的5’端-3’端外切酶活性，在PCR反应系统中加入标记过的探针。该探针可与引物扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标记为异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(6-FAM)或生物素(Biotin)中的一种，探针的3’端标记为异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(6-FAM)或生物素(Biotin)中的一种，探针的5’端和3’端标记不同的显色基团；试纸条上有识别上述显色基团的特异性抗体。当模板中不含有目的片段的时候，探针没有结合的对象，不会被Taq酶切断，能保持探针的完整。当探针保持完整时，显色基团能够被特异性抗体识别，试纸条出现两条红色条带，检测结果即判定为阴性。当PCR反应体系中有目的片段存在，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交；PCR反应就会扩增出特异核酸片段，当PCR进入延伸(复制)期，Taq酶从引物3’端开始，随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合位置时，其Taq酶5’端-3’端外切酶活性作用，将探针切断，从而不能被特异性抗体识别，试纸条只出现一条红色条带，检测结果即判定为阳性。一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，核酸组合包括引物对和探针，引物对的碱基序列如SEQIDNO.1-2所示，探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，探针的5’端标记第一显色基团和探针的3’端标记有第二显色基团。进一步地，第一显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；第二显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；第一显色基团不同于第二显色基团。该引物对能特异识别出猪伪狂犬病毒的特异区段，具有较强的特异性，同时探针也是针对猪伪狂犬病毒的特异区段进行设计，同样具有较高的特异性；能够在样本含量很低的情况下，检测出样本来，所以上述的核酸组合也具有较高的灵敏度。而探针通过标记异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin，通过标记使探针发挥作用，更有利于对伪狂犬病毒检测；而且，探针的5’端和3’端标记不同显色基团，能够交叉验证，避免发生误检的情况，使检测的结果更为准确和合理。上述核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用。进一步地，上述核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用时，以待检样本DNA或cDNA为模板，加入上述引物对和探针，进行PCR反应。进一步地，上述PCR扩增反应的程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，58-63℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环，72延伸2min。选择58-63℃退火温度，能扩增出特异性的条带，避免扩增出非特异的条带干扰实验结果，40个循环能扩增出大量片段，将微量的模板放大，利于检测。上述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在制备检测伪狂犬病毒试剂盒中的应用。应用上述的核酸组合，能是检测结果更准确可靠。一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，包括上述的核酸组合。进一步地，上述试剂盒还包括试纸条，试纸条包被有识别第一显色基团的第一特异性抗体和识别第二显色基团的第二特异性抗体。通过试纸条上包被抗体，通过抗原抗体反应和显色，能提高反应灵敏度、特异性和准确性。而且识别简单，一目了然，能清楚、直观、准确的反映出检测结果。进一步地，试纸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括引物对和探针，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1‑2所示，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针的5’端标记第一显色基团和所述探针的3’端标记有第二显色基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括引物对和探针，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.1-2所示，所述探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，所述探针的5’端标记第一显色基团和所述探针的3’端标记有第二显色基团。2.根据权利要求1所述的检测伪狂犬病毒的核酸组合，其特征在于，所述第一显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；所述第二显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；所述第一显色基团不同于所述第二显色基团。3.如权利要求1或2所述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其包括：以待检样本的DNA或者cDNA为模板，加入所述核酸组合的所述引物对和所述探针，进行PCR扩增反应。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应的程序为：94℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：周远成，蔡雨函，邓静，王翱，李碧，卓秀萍，牛婷，钟颖，阴文奇，邝声耀，
申请(专利权)人：四川华神兽用生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51