The invention discloses a method for eliminating the endogenous nucleic acid pollution brought by an PCR reaction reagent. Based on the sources of the PCR reaction material, the potential contamination fragments are identified based on the results from the NCBI database comparison. The contaminated fragment was also analyzed to determine the restriction endonuclease site contained in the fragment. The use of restriction enzyme suitable for PCR reaction liquid pre digestion, when endogenous nucleic acid DNA in the reaction solution was removed after endogenous nucleic acid DNA can not be used as a template for PCR amplification, the reaction results eliminate false positives due to endogenous DNA nucleic acid contamination. The method of the invention can eliminate the influence of the endogenous nucleic acid DNA on normal amplification, and does not hinder normal PCR amplification and specificity.
【技术实现步骤摘要】
一种消除PCR反应试剂自带的内源核酸污染的方法
本专利技术属于生物
,涉及一种基于II型限制性核酸内切酶消除PCR反应试剂自带的内源核酸污染的方法。技术背景聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR),是现阶段体外酶促合成特异DNA片段的一种常用且高灵敏度的方法。然而,过高的灵敏度使得PCR反应会因为核酸污染而产生假阳性结果,这是PCR方法面临的最大问题。虽然最常见的PCR污染是产物污染,但是在配置PCR反应体系的各种原材料中也存在着能够引起假阳性实验结果的污染源。在PCR反应试剂中,DNA聚合酶主要来源于大肠杆菌工程菌株,目前市面上销售的DNA聚合酶都不能保证其中没有细菌DNA,只是DNA的拷贝数多与少的问题。同时,市面上销售的dNTP也主要消化自细菌基因组DNA,因此也不能保证其中没有基因组DNA的存在。因此,在进行实时荧光定量PCR时,在没有产物污染的情况下,也存在由于设计的引物与内源核酸匹配而引起假阳性结果的可能。目前,常用的和主流的防污染方法主要针对PCR产物,对于反应原材料中携带性核酸污染的去除研究较少,主要是通过过滤的方式尽可能的去除内源污染。但是使用过滤法不能完全去除内源性核酸,同时还会产生大量的浪费。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种消除聚合酶链式反应体系原材料中自带的内源污染,排除由于内源核酸而产生的PCR假阳性实验结果。而本专利技术采取的利用II型限制性核酸内切酶建立的防止内源性污染方法既能够去除内源核酸又不会产生不必要的浪费。本专利技术包括的实验步骤:(1)、依据供货商提供的资料确定DNA聚 ...
【技术保护点】
一种消除聚合酶链式反应体系原材料中自带的内源污染,防止PCR假阳性存在的方法,其特征在于,包括步骤:(1)、依据供货商提供的资料确定DNA聚合酶和dNTP的来源菌株,利用NCBI数据库,以来源菌株的种类为首选,对设计的引物进行序列比对,找寻潜在的结合位点,确认可能存在的污染片段;(2)、对污染片段进行酶切位点分析,找出序列中存在的限制性核酸内切酶,选取适宜的II型限制性核酸内切酶;(3)、将PCR反应体系在适宜的酶切温度下孵育一段时间,从而使得所述的限制性核酸内切酶完全消化反应体系中存在的内源核酸污染;(4)、灭活PCR反应体系中的所述II型限制性核酸内切酶,从而获得II型限制性内切酶被灭活的PCR反应体系。
【技术特征摘要】
1.一种消除聚合酶链式反应体系原材料中自带的内源污染,防止PCR假阳性存在的方法,其特征在于,包括步骤:(1)、依据供货商提供的资料确定DNA聚合酶和dNTP的来源菌株,利用NCBI数据库,以来源菌株的种类为首选,对设计的引物进行序列比对,找寻潜在的结合位点,确认可能存在的污染片段;(2)、对污染片段进行酶切位点分析,找出序列中存在的限制性核酸内切酶,选取适宜的II型限制性核酸内切酶;(3)、将PCR反应体系在适宜的酶切温度下孵育一段时间,从而使得所述的限制性核酸内切酶完全消化反应体系中存在的内源核酸污染;(4)、灭活P...
【专利技术属性】
技术研发人员:卿志荣,周雪,桑嘉欣,
申请(专利权)人:江苏睿玻生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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