用于检测人类HLA‑B*5701等位基因的核酸、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了用于检测人类HLA‑B*5701等位基因的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测人类HLA‑B*5701等位基因的检测方法。本发明专利技术提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

For nucleic acid, reagent kit and method for detection of human HLA B*5701 allele

The invention discloses a kit for detecting human HLA nucleic acid and alleles of B*5701, and establish the detection method with strong specificity, high sensitivity, high accuracy, simple operation and detection of human HLA B*5701 allele. The method provided by the invention adopts fully closed tube operation, simple operation, convenient and quick, the fluorescence signal process of direct detection PCR value obtained from the test results, do not need PCR postprocessing or electrophoresis detection, to overcome the conventional PCR technology is easy to be polluted, false positive, can effectively avoid the problem of non specific amplification. Detection and is suitable for batch samples.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测人类HLA-B*5701等位基因的核酸、试剂盒及方法。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus；abbr:HIV)，即艾滋病(AIDS，获得性免疫缺陷综合征)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。1983年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus)，属逆转录病毒的一种。阿巴卡韦(abacavir，ABC)是一种抗艾滋病新药，为新的碳环2'-脱氧鸟苷核苷类药物，其口服生物利用度高，易渗入中枢神经系统。与其他核苷类逆转录酶抑制剂一样，它是一个无活性的前药，在体内经4个步骤代谢成为具活性的三磷酸酯，并通过以下2条途径发挥抑制人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶的作用：①竞争性地抑制2'-脱氧鸟苷三磷酸酯(dGTP)(DNA合成片段之一)结合进入核酸链。②通过阻止新碱基的加入而有效地终止DNA链的合成。阿巴卡韦(Abacavir,ABC)是一种核苷类反转录酶抑制剂，从1999年即作为经典的联合用药中的一种药物，被欧美一些国家采用，目前，仍是美国食品与药品管理局推荐的初次服用的首选药物。但是，据现有的资料报道，服用阿巴卡韦药物后，大约有5％－8％的人会出现ABCHSR。ABCHSR是一种多器官综合征，会出现两种或两种以上的体征或症状，甚至可以导致偶发的、严重的致死性超敏反应。ABC从一开始应用即被发现对部分服用者，有较严重的超敏反应(Hypersensitivityreaction,HSR)，为了避免严重超敏反应的发生,众多研究者致力于发展一种安全有效的筛查方法。2002年，Mallal等首次研究发现，阿巴卡韦斑贴实验阳性者人群遗传的MHC位点的57.1单体型基因频率更高。由此推测发病机制，可能是MHC基因的这个位点与阿巴卡韦代谢生成一种具有免疫性的内源蛋白有关，HLA位点上的HLA-B*5701基因被推测为重要的危险因素。在细胞以及体外实验中，α－肿瘤坏死因子(TNF－α)及γ－干扰素(IFN－γ)的强烈应答，以及CD8+细胞在体外暴露于阿巴卡韦后，产生的增殖均证明了，ABCHSR是由HLA-B*5701限制性的CD8+T淋巴细胞介导的I类主要组织相容性复合体疾病，其阳性预测阿巴卡韦过敏反应准确率超过70％，阴性预测准确率达95％－98％。2008年7月，FDA对有关研究进行回顾分析后提出建议：在治疗前对患者进行HLA-B*5701等位基因筛选，并对检测为阳性的患者选择替代疗法，除非用药的潜在效益大于风险,否则不建议HLA-B*5701阳性患者使用阿巴卡韦治疗。目前，欧美一些国家已经将HLA-B*5701等位基因筛查应用于临床常规检测，在治疗前对患者进行HLA-B*5701等位基因筛选，并对检测为阳性的患者选择替代疗法，除非用药的潜在效益大于风险，否则不建议HLA-B*5701阳性患者使用阿巴卡韦治疗。HLA-B*5701等位基因筛查的应用，对于艾滋病的治疗是有极其重要的意义的：第一，它降低了ABCHSR的发生率，使HIV的治疗风险降低；第二，它的特异度高于临床诊断、皮肤斑贴实验，可以使更多的患者接受ABC的有效治疗，避免了临床过度诊断而错过阿巴卡韦药物治疗机会；第三，HLA-B*5701等位基因筛查大大节约了医疗费用。目前检测该等位基因的方法主要有PCR-SSP、PCR-SSO和PCR-SBT法。PCR-SSP和PCR-SSO检测范围广，操作繁琐，检测失败率高，易出现假阴性，产品内容需每年更新，成本昂贵；PCR-SBT检测范围广，检测周期长，产品内容需每年更新，成本昂贵。上述三种方法都不适用于只检测某一种等位基因型。
技术实现思路
为克服以上现有检测方法的不足，本专利技术的目的是提供一组用于检测人类HLA-B*5701等位基因的核酸。本专利技术的另一个目的是提供一种用于检测人类HLA-B*5701等位基因的试剂盒及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一组用于检测人类HLA-B*5701等位基因的核酸，该核酸包括用于2孔反应体系检测的引物对1和检测探针1，引物对2和检测探针2；其中，所述引物对1的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述检测探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述引物对2的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，所述检测探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。如上所述的核酸，优选地，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。如上所述的核酸，优选地，所述核酸还包括用作引物对1扩增的阳性对照物1、与用作引物对2扩增的阳性对照物2和用作内部质控的质控阳性对照物，其中，所述阳性对照物1含有如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，所述阳性对照物2含有如SEQIDNo.11所示的核苷酸序列，和/或所述质控阳性对照物含有如SEQIDNo.12所示的核苷酸序列。一种用于检测人类HLA-B*5701等位基因的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的核酸，所述检测探针1和检测探针2的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，和/或质控探针的5＇端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的荧光基团，3＇端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的淬灭基团。如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括：10×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、矿物油、阴性对照物：水。如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。一种检测人类HLA-B*5701等位基因的方法，该方法包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对提取的所述DNA，同时进行反应体系1和反应体系2的实时荧光PCR扩增；其中，所述反应体系1中引物对1的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，检测探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述反应体系2中引物对2的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，检测探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述检测探针1和检测探针2的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品的所述反应体系1和所述反应体系2的荧光增长曲线均超过阈值线，有明显的扩增曲线，则判断为阳性，如所述反应体系1和所述反应体系2中任一反应体系无明显的扩增曲线或均无明显的扩增曲线，判断为阴性。如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述反应体系1和所述反应体系2还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的荧光基团，3＇端连接有淬灭基团。如上所述的方法，优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测人类HLA‑B*5701等位基因的核酸，其特征在于，该核酸包括用于2孔反应体系检测的引物对1和检测探针1，引物对2和检测探针2；其中，所述引物对1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述检测探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述引物对2的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述检测探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测人类HLA-B*5701等位基因的核酸，其特征在于，该核酸包括用于2孔反应体系检测的引物对1和检测探针1，引物对2和检测探针2；其中，所述引物对1的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述检测探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述引物对2的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，所述检测探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包括用作引物对1扩增的阳性对照物1、与用作引物对2扩增的阳性对照物2和用作内部质控的质控阳性对照物，其中，所述阳性对照物1含有如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，所述阳性对照物2含有如SEQIDNo.11所示的核苷酸序列，和/或所述质控阳性对照物含有如SEQIDNo.12所示的核苷酸序列。4.一种用于检测人类HLA-B*5701等位基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3中任一所述的核酸，所述检测探针1和检测探针2的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，和/或所述质控探针的5＇端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的荧光基团，3＇端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的淬灭基团。5.如权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：10×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、矿物油、阴性对照物：水；所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。6.一种检测人类HLA-B*5701等位基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对提取的所述DNA，同时进行反应体系1和反应体系2的实时荧光PCR扩增；其中，所述反应体系1中引物对1的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，检测探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述反应体系2中引物对2的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，检测探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述检测探针1和检测探针2的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品的所述反应体系1和所述反应体系2的荧光增长曲线均超过阈值线，有明显的扩增曲线，则判断为阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐俊，段卫涛，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42